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第一部分体外诱导E14小鼠ESC分化为肝细胞的研究.目的:基于肝脏发育生物学进展,建立有效诱导胚胎干细胞(ESC)向肝细胞分化的体外培养体系.方法:小鼠ESC细胞系E14,在内含1000U/ml的rmLIF的无饲养层高糖DMEM培养基中培养,去除rmLIF后用悬滴培养法制备成拟胚体.依次加入10<-7>M的Dexamethasone、10ug/L的FGF-4、25ug/L的HGF等诱导因子,继续培养1-2周.然后取分化细胞,行细胞形态学观察、免疫细胞化学染色检测白蛋白和CK8/18的表达、RT-PCR检测白蛋白和转甲状腺蛋白等肝细胞特征性蛋白的mRNA转录水平.糖原染色、尿素合成功能检测则对其功能进行检验.结论:1.加入FGF-4、HGF和Dex等肝脏胚胎发育时期的关键性调控因子的体外培养体系可以诱导胚胎干细胞分化为肝细胞样细胞.2.发育生物学在ESC定向诱导分化研究中有一定的指导意义.第二部分淤胆血清"病理微环境"下ESC中肝干细胞的筛选.目的:探讨淤胆血清"病理微环境"培养体系诱导胚胎干细胞(ESC)向肝细胞分化的效果及对肝干细胞的筛选作用.方法:将小鼠ESC细胞系E14在无白血病抑制因子培养基中培养,使其自发分化为拟胚体,加入FGF-4和HGF初步诱导,然后置于5％淤胆鼠血清"病理微环境"筛选培养液中继续培养2周,然后进行细胞形态学观察,白蛋白和CK8/18免疫荧光染色,电镜检查和吲哚氰绿(ICG)摄取试验.结论:采用含淤胆血清的"病理微环境"培养体系从经FGF-4和HGF初步诱导的胚胎干细胞中有效筛选出了具有功能的肝细胞样细胞,细胞有较好的均质性,为临床肝细胞替代治疗的获取丰富供体细胞来源提供了新思路.第三部分ESC源性肝干细胞在治疗性肝再生中的应用.目的:应用治疗性肝再生模型进行ESC源性肝干细胞肝内移植,观察其在肝组织替代、体内的生长分化及成瘤性等情况,为ESC移植在难治性肝病治疗中的临床应用提供实验依据.方法:倒千里光碱+70%肝部分切除建立BALB/c小鼠的治疗性肝再生模型.用荧光示踪剂CFDA SE标记移植细胞,将经淤胆血清"病理微环境"筛选体系筛选出的ESC源性肝干细胞经门静脉移植入治疗性肝再生模型小鼠肝内.然后荧光显微镜下观察,检测移植细胞体内分布、整合与肝细胞替代、体内生长分化等情况.2周后行白蛋白荧光免疫组化(双荧光染色)、血清白蛋白水平检测其功能状况.并通过观察其体内成瘤性对筛选出的ESC源性肝干细胞的安全性进行评估.结论:经淤胆血清"病理微环境"筛选体系筛选出的ESC源性肝干细胞移植入治疗性肝再生模型鼠肝内后可有效整合入宿主肝板、在肝内能进一步生长分化并部分表达肝细胞功能.其安全性较好,6w内未见畸胎瘤形成.