血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)被认为是促进血管生成的关键因素之一,血管内皮生长因子亚型包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盘生长因子(PLGF),血管内皮生长因子的生物效应是通过血管内皮生长因子特异性受体介导完成的。VEGF-C是VEGF的亚型之一,VEGF-C能够促进淋巴管生长,肿瘤细胞分泌VEGF-C与细胞受体VEGFR-3相互作用,组成了自分泌信号轴,通过一系列生化反应可导致肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。鼻咽癌易发生淋巴结转移,目前鼻咽癌治疗是以放疗为主综合治疗。本研究选择VEGF的亚型VEGF-C作为研究对象,首次探讨VEGF-C对鼻咽癌细胞CNE-2增殖、凋亡、DNA损伤和辐射敏感性等生物学行为的影响,并阐明其相关分子机制,为鼻咽癌放射治疗联合抗VEGF-C治疗提供理论支持和实验基础,也为鼻咽癌的靶向治疗提供一个有效的靶点。目的:阐明VEGF-C增加鼻咽癌细胞CNE-2的辐射抗性作用及其机制,并为在临床上放射治疗联合抗VEGF-C治疗提供理论支持。方法:(1)照射条件为:Synergy VMAT(Elekta,瑞典),细胞单次受照剂量8Gy X-射线,剂量率300cGy/min;(2)CCK-8法检测细胞增殖活性;(3)采用基因工程,分别构建阴性对照组和siRNA-VEGF-C干扰组;(4)实时定量PCR法检测VEGF-C mRNA表达量;(5)集落形成实验检测CNE-2细胞的放射敏感性;(6)Western blot法检测VEGF-C、cyclinD1、GADD45β、p65NF-κB、p-p65、IκB、p-IκB、Bax、Bcl-2、caspase3、C-caspase3、Bim and caspase-9蛋白表达量;(7)采用流式细胞术检测CNE-2细胞凋亡水平;(8)采用彗星实验检测DNA损伤情况;(9)细胞免疫荧光染色法检测VEGF-C与p-p65共表达情况;(10)采用荧光素酶报告实验,检测p65与ATM启动子结合情况;(11)动物模型建立与分组:建立免疫缺陷裸鼠皮下荷瘤动物模型,将荷瘤鼠分为:瘤体组,阴性对照组,干扰组,照射组,阴性对照组+照射组,照射组+干扰组共6组。观察瘤体大小变化及相关蛋白表达水平变化;(12)统计方法:分析数据采用Student’st-test,p<0.05表示差异有统计学意义;应用ImageJ软件做蛋白电泳条带灰度分析。结果:1、VEGF表达影响鼻咽癌患者预后Meta分析表明:鼻咽癌患者组织中VEGF低表达总生存(overall survival,OS)优于VEGF高表达患者,两者风险比(Hazard rate HR)2.07,95%可信区间:1.32-3.25,I~2=79.1%,显著相关性。鼻咽癌患者组织中VEGF低表达无病生存期(disease-free survival,DFS)优于VEGF高表达患者,两者间风险比HR 5.99,95%可信区间:2.66-13.48,I~2=50.2%,具有显著相关性。鼻咽癌患者血清中VEGF低表达总生存与VEGF高表达患者短期总生存显著相关(HR 2.47,95%可信区间1.16-5.28,I~2=45.2%)。鼻咽癌患者中VEGF表达与预后有关。2、干扰VEGF-C表达提高CNE-2的辐射敏感性我们比较不同头颈部细胞株VEGF-C蛋白表达,结果发现鼻咽癌CNE-2细胞株中VEGF-C高表达(P<0.05);我们检测2、4、6、8、16Gy不同剂量X-射线照射,24小时后VEGF-C表达,发现8Gy X-射线照射24小时后VEGF-C表达明显升高(P<0.05);给予8Gy X-射线照射后0h、6h、12h、24h、48h不同时间,检测VEGF-C表达,发现24小时后VEGF-C明显升高(P<0.05),因此我们选择鼻咽癌细胞CNE-2,8Gy X-射线照射24小时后,行后续实验。采用基因工程干扰鼻咽癌细胞CNE-2中VEGF-C,构建阴性对照组和siRNA-VEGF-C组,干扰48h之后,相对于阴性对照组细胞和正常组细胞,干扰组VEGF-C mRNA和蛋白表达量显著降低(P<0.01),成功干扰鼻咽癌细胞CNE-2中VEGF-C的表达。干扰VEGF-C48小时后,siVEGF-C细胞增殖显著低于阴性对照组细胞和正常组细胞(P<0.05);siVEGF-C+照射组细胞增殖显著低于阴性对照+照射组细胞和正常照射组细胞(P<0.01),说明干扰VEGF-C表达抑制细胞增殖。siVEGF-C组细胞克隆半径显著低于阴性对照和正常组细胞(P<0.05);siVEGF-C+照射组细胞克隆数目和克隆半径显著低于阴性对照+照射组细胞和正常+照射组细胞(P<0.01),说明干扰VEGF-C提高细胞辐射敏感性。siVEGF-C+照射组细胞凋亡明显高于阴性对照+照射组细胞和正常+照射细胞组(P<0.01),说明干扰VEGF-C表达提高辐射引起凋亡。siVEGF-C组细胞DNA损伤程度高于阴性对照组细胞和正常细胞组(P<0.01);与阴性对照+照射组细胞和正常+照射组细胞相比,siVEGF-C+照射组细胞彗星拖尾现象明显,DNA损伤程度较重,差距有统计学意义(P<0.01),说明干扰VEGF-C表达增加DNA损伤。上述实验说明干扰鼻咽癌细胞CNE-2中VEGF-C可通过抑制细胞增殖,增加凋亡和DNA损伤,进而降低辐射抗性。3、NF-κB在VEGF-C介导的辐射抗性中的作用及机制上述实验说明干扰VEGF-C可增加CNE-2辐射敏感性,通过哪些信号通路,是我们在机制中需要解决问题。我们把siVEGF-C、阴性对照组、阴性对照组+照射组、siVEGF-C+照射组四组建库,采用高通量测序技术观察全基因转录情况。我们通过差异基因、GO分析和KEGG分析,选取高表达差异基因,进行PCRarry检测,发现VEGF-C可能通过NF-κB与ATM互相调控作用,发生了caspase3依赖性凋亡;NF-κB的IκB影响细胞周期蛋白cyclinD1表达,进而影响细胞增殖,因此我们选择其中NF-κB信号通路,作为研究VEGF-C对辐射敏感性影响的下游信号通路。通过实验我们发现相对于阴性对照组细胞和正常组细胞,siVEGF-C细胞p-p65蛋白表达水平显著增加(P<0.05)。与照射组相比,siVEGF-C+照射组p-p65(S536)、p-IκB的蛋白表达明显增加(P<0.05)。采用细胞免疫荧光染色实验,结果发现VEGF-C与p-p65在细胞核中共表达,辐射使鼻咽癌细胞CNE-2中p-p65表达增加。上述结果表明干扰VEGF-C可提高辐射激活p-p65的蛋白表达。我们通过荧光素酶报告实验,检测p65与ATM启动子相结合,进而影响ATM转录。BAY11-7082是NF-κB抑制剂,与照射组相比,我们检测siVEGF-C+照射组下游影响凋亡基因发现C-caspase3、Bim、Bax、caspase9蛋白表达水平显著升高(P<0.05),Bcl-2下降(P<0.05),Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05);而BAY11-7082+照射组细胞+siVEGF-C细胞与照射组相比上述指标没有统计学差异。检测凋亡水平变化发现在正常组、照射组、siVEGF-C细胞+照射组、siVEGF-C细胞+照射组+BAY11-7082四组细胞中,siVEGF-C细胞+照射组凋亡率最高(P<0.01),说明干扰VEGF-C增加辐射敏感性,而加入BAY11-7082凋亡率下降(P<0.01),则证实siVEGF-C细胞辐射增敏作用是通过上调NF-κB实现的。上述实验表明,与照射组相比,照射+siVEGF-C组通过NF-κB信号通路影响ATM转录,ATM下调使Bax表达升高、Bcl-2表达下降,同时检测NF-κB下游与凋亡有关基因变化,发现C-caspase3、Bim和caspase-9的蛋白表达升高,而Bcl-2/Bax比值降低,上述蛋白变化导致CNE-2细胞凋亡增加,增加辐射敏感性。我们检测GADD45β发现:干扰VEGF-C后,GADD45β升高(P<0.05);与照射组相比,siVEGF-C细胞+照射组中GADD45β升高(P<0.05),GADD45β升高导致DNA损伤加重。采用荧光素酶报告实验发现p65与ATM启动子相结合,免疫组化结果表明与照射组相比,siVEGF-C+照射组ATM降低,ATM降低导致DNA修复下降。采用彗星实验发现,siVEGF-C+照射组与照射组相比DNA损伤最严重(P<0.05),说明干扰VEGF-C增加辐射敏感性,加入BAY11-7082DNA损伤下降(P<0.01)。实验结果表明干扰VEGF-C可通过GADD45β升高,DNA损伤加重;ATM下调使DNA修复减弱,这些原因导致DNA损伤加重,增加辐射敏感性。我们检测cyclin D1发现:干扰VEGF-C后,cyclin D1降低(P<0.05);与照射组相比,siVEGF-C细胞+照射组中cyclin D1降低(P<0.05),cyclin D1降低导致细胞增殖受阻。我们集落形成实验表明:与照射组相比,siVEGF-C细胞+照射组克隆数目和克隆半径明显降低(P<0.05),说明干扰VEGF-C增加辐射敏感性;加入BAY11-7082克隆数目和克隆半径增加(P<0.05)。实验结果表明,干扰VEGF-C可使cyclin D1下降,导致细胞周期受阻,ATM下调也使细胞周期发生阻滞,细胞周期阻滞导致细胞增殖受阻,增加辐射敏感性。4、体内动物实验发现干扰鼻咽癌细胞CNE-2中VEGF-C表达提高辐射敏感性我们向裸鼠腋下皮下注射鼻咽癌细胞CNE-2,每日观察瘤体生长情况,待瘤体直径达到0.7cm左右,将裸鼠随机分为六组,每组4只:第一组为瘤体组;第二组为阴性对照组,瘤体内注射试剂siRNA-NC,每天注射浓度为50nM的siRNA-NC注射液50μl,连续注射4天;第三组为注射试剂siRNA-VEGF-C-1,每天注射浓度为50nM siVEGF-C-1注射液50μl,连续注射4天;第四组为照射组,我们前期细胞实验表明8Gy照射,VEGF-C表达最高,因此本次动物实验我们采用瘤体每日进行2Gy X射线照射,连续照射4天;第五组为siRNA-NC+照射组,瘤体内皮下注射试剂siRNA-NC,连续注射4日,瘤体每日照射2Gy,连续照射4天;第六组为siVEGF-C-1注射+照射组,瘤体内皮下注射试剂si-VEGF-C-1,连续注射4日,瘤体每日照射2Gy,连续照射4天。照射后继续饲养裸鼠15天,每天观察肿瘤生长情况,每三天用游标卡尺对肿瘤体积测量一次,V=a~2×b/2(a为瘤体长径、b为瘤体短径)。15天后处死裸鼠进行瘤体取材,比较肿瘤大小。结果发现,干扰VEGF-C组肿瘤小于阴性对照组和正常组;干扰组+照射组肿瘤小于照射组和阴性对照组+照射组。免疫组化结果表明:干扰VEGF-C后,VEGF-C、ATM降低和p65升高,与照射组相比,干扰组+照射组VEGF-C、ATM降低。动物实验发现干预VEGF-C可通过NF-κB信号通路增加放射敏感性,与体外结果相一致。结论:(1)VEGF-C影响鼻咽癌细胞CNE-2的辐射敏感性:干扰鼻咽癌细胞CNE-2中VEGF-C表达增加辐射引起细胞增殖抑制、DNA损伤和细胞凋亡,进而增加辐射敏感性。(2)干扰鼻咽癌细胞CNE-2中VEGF-C,可通过提高辐射激活NF-κB信号通路,进而抑制NF-κB下游ATM转录,ATM通过对凋亡基因的影响,引起CNE-2细胞凋亡增加,进而增加辐射敏感性。(3)干扰VEGF-C,使可使cyclin D1、ATM下调,引起细胞周期阻滞,细胞增殖受阻,导致辐射敏感性增加。(4)干扰VEGF-C通过GADD45β上调,ATM降低,导致DNA损伤加重,影响辐射敏感性。(5)通过动物实验发现干扰VEGF-C后,移植瘤生长速度降低,辐射敏感性增加。