细胞内蛋白分选复合体ESCRT(Endosomal Sorting Complex Required for Transport)是生物体内重要的大分子蛋白质机器,最早发现于蛋白分选的MVB(multivesicular bodies,MVB)囊泡运输系统中,并在细胞分裂、病毒出芽,神经退行性疾病以及质膜损伤修复等细胞内重要过程中起重要作用。在细胞内,ESCRTⅢ复合体在ATP酶Vps4的作用下不断地组装和解聚,共同构成了细胞内的分子剪切机器,对于囊泡的切割和分离起到了重要作用。近年来,相关蛋白复合体的结构逐步被解析出来,但Vps4解聚ESCRTⅢ复合体的动态分子作用机制尚不清楚。ESCRTⅢ复合体各蛋白组份的排布方式、Vps4与ESCRTⅢ复合体的结合方式以及作用方式、解聚过程中ESCRTⅢ复合体的各蛋白组份解离顺序等问题都尚未清楚。这些问题也是研究ESCRT复合体非常重要的方面,因此,本文主要致力于构建研究ESCRTⅢ复合体解聚的动态过程的方法。本文主要利用生化手段、负染电镜和单分子荧光等手段,致力于构建适用于单分子检测的ESCRTⅢ蛋白系统。通过分析ESCRTⅢ蛋白的结构,选取不影响结构稳定和纤丝形成的氨基酸进行突变,将ESCRTⅢ各组成蛋白突变为带有一个Cys的突变体,体外提取突变蛋白检测蛋白的稳定性,吸收光谱检测突变蛋白荧光标记的效率,负染电镜观察突变蛋白形成纤丝的能力,负染电镜观察和离心沉淀实验分析突变体蛋白形成的纤丝被Vps4解聚的能力。本文主要选取了ESCRTⅢ主要组分蛋白Snf7的loop区上的5个位点,K57、G58、N59、G120和D122,分别突变为Cys(半胱氨酸),其中K57C突变体蛋白不稳定聚沉,G58C突变体蛋白荧光标记效率低,N59C和G120C突变体蛋白影响纤丝形成,只有D122C突变体蛋白稳定,标记效率高,且标记后的蛋白能正常形成纤丝并被Vps4蛋白解聚。最终筛选出了Snf7-122C突变体,该蛋白可适用于进一步利用单分子技术检测ESCRTⅢ纤丝的解聚动态过程,并确定了所构建实验流程及方法的可行性。