论文部分内容阅读
鲎素(TachyplesinⅠ)是一种由17个氨基酸残基组成的抗菌肽，可抑杀细菌、真菌、病毒及抑制肿瘤细胞增殖和诱导癌细胞分化，在养殖、食品和医学领域具有重要的研究价值。迄今为止，细菌对鲎素可否产生抗药性尚不清楚以及鲎素抑杀细菌的分子机制尚未阐明。本研究通过5个试验系统探讨了鲎素能否诱导细菌产生抗药性并揭示其相关机制。
1、通过连续诱导和非连续诱导2种方法探讨鲎素能否在体外诱导大肠杆菌ATCC25922、F41和金黄色葡萄球菌ATCC25923产生抗药性?采用注射用青霉素钠作阳性对照，相应的无药组作阴性对照，通过测定鲎素对各代诱导菌株的MIC值来判定细菌是否产生了抗药性；随后对诱导菌株进行抗药稳定性及交叉抗药性的研究，并通过扫描和透射电镜对诱导前后菌株表面形态和超微结构进行观察。结果表明：(1)、连续增高浓度的鲎素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌(≤20代诱导)未诱导出抗药性，而青霉素钠对金黄色葡萄球菌诱导出了明显的抗药性，其菌株命名为QP诱导菌株；(2)、QP诱导菌株在无药营养肉汤中连续传代8次后，抗药性不稳定；(3)、鲎素与青霉素钠无交叉抗药性；(4)、细菌经过连续增高浓度的鲎素诱导20代后，外部形态和超微结构均发生了变化。结果显示，在本试验条件下，与抗生素相比，鲎素不易使细菌产生抗药性。
2、为了揭示鲎素不易诱导细菌产生抗药性的原因，本试验研究了鲎素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌动力学，并结合激光共聚焦扫描显微镜(LSCM)、扫描和透射电镜观察了鲎素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌动态及鲎素浓度与杀菌时间的相互关系；通过电镜观察了鲎素对诱导菌株和原始菌株杀菌靶点的异同以及鲎素和青霉素钠对金黄色葡萄球菌杀菌靶点的异同。结果表明：(1)、鲎素能抑制这2种细菌的对数生长期的菌体分裂，并对这2种细菌的抑菌动力学不同；20μg/mL鲎素在60 min内对大肠杆菌的杀死率为97.5％，而10μg/mL鲎素对金黄色葡萄球菌在30 min内杀死率为89.65%。(2)、LSCM结果表明20μg/mL FITC标记的鲎素立即作用于大肠杆菌细胞膜，在几分钟内使细胞膜破裂，内容物流出，杀菌作用呈现明显的浓度时间依赖关系；对金黄色葡萄球菌来说，同浓度的鲎素也是首先作用于细胞膜，随后在细胞膜上累积，主要作用于胞内物质，但在10 min内未看到膜破裂；(3)、电镜结果表明鲎素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的作用靶点是细胞膜、核区及细胞内其它内容物；(4)、鲎素对大肠杆菌诱导菌株和原始菌株的作用靶点相似；鲎素与青霉素钠对金黄色葡萄球菌的作用靶点不同。
3、为了研究鲎素对细菌细胞壁膜、胞内酶活性的影响，通过电导率方法检测了细菌细胞膜渗透性；采用流式细胞仪定量检测了细胞受损情况及胞内酶系的变化。结果表明：(1)、不同浓度的鲎素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别作用1.5 h和3h，其细胞均出现细胞质渗漏；(2)、鲎素通过破坏大肠杆菌细胞壁膜，引起胞内酯酶失活，导致菌体死亡，但低浓度(5μg/mL)时胞内酯酶失活状况与细胞膜的破损并非同步进行。结果显示，鲎素通过破坏细胞膜造成细胞渗透性增强，内容物外泄，细胞代谢停止，直至死亡。
4、为了进一步揭示鲎素对细菌基因组DNA的影响，本试验以GelRedTM为荧光探针,通过琼脂糖凝胶阻滞电泳、荧光和紫外光谱的方法研究了鲎素与基因组DNA的相互作用。结果表明：(1)、鲎素能够与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌基因组DNA发生作用，呈浓度依赖关系，在≥80μg/mL浓度时导致基因组DNA断裂；(2)、鲎素可与大肠杆菌基因组DNA以沟槽和静电作用的方式结合，而与金黄色葡萄球菌基因组DNA则以嵌入作用方式结合。结果显示，鲎素能与基因组DNA结合，高浓度时导致DNA断裂。
5、通过基因芯片技术在转录水平上进一步研究了鲎素对大肠杆菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923诱导前后基因表达的影响，以期在全基因组水平上研究鲎素的抗菌机制，并探讨其不易使细菌产生抗药性的原因。结果表明：(1)、1.25μg/ml鲎素处理大肠杆菌60 min后，处理组与对照组表达差异2倍以上基因有592个，其中上调基因159个，下调基因433个；其中与细胞组成相关基因占6.43%，与分子功能相关的基因占55.5%，与生物过程相关的基因占38.07%；(2)、5μg/mL鲎素处理金黄色葡萄球菌30 min后，处理组与对照组基因表达差异2倍以上的基因有274个，其中上调基因177个，下调基因97个；(3)、用荧光定量PCR对基因芯片的结果在mRNA水平上进行了验证，结果显示qPCR的结果与基因芯片的检测结果基本一致。
综上所述，鲎素不易诱导大肠杆菌和金黄色葡萄球菌产生抗药性，这可能与它的作用靶点多有关。