目的:随着社会的发展,人们逐渐意识到化学合成类药品给人类自身健康及生活环境带来的负面影响,回归自然、保护环境已成为一种处理人类和环境关系的潮流思想。天然药物以其在治疗上的独特优势（来自大自然,毒副作用小及治病范围广）而倍受重视。然而大多数天然药物的成分不明,炮制方法单一。其有效成分的分离纯化技术低下,治病机制大多不为人知,因此限制了其应用范围。为了更好的利用天然药物,对其有效成分进行分离纯化并研究其作用机制迫在眉睫。近年来,大量研究发现真菌和植物的次生代谢产物在抗肿瘤、抗炎、提高免疫力等方面有显著的作用。2014年本课题组从一种食药兼用的大型真菌—黃乳粘盖牛肝菌的石油醚相中纯化出一种代谢产物,化学名称为:3,6-二羟基-2-（2Z,6E,10E）-3,7,11,15-六甲基十六碳-2,6,10,14-四烯苯乙酯,和之前研究发现的牛肝菌素是同分异构体,命名为异牛肝菌素（iso-suillin）,经过几年的研究发现,iso-suillin表现出较强的生物活性,能够有效抑制SMMC-7721、BGC、K562、A549等肿瘤细胞系的生长,而且与顺铂（CDDP）和5-氟尿嘧啶（5-FU）比较,iso-suillin表现出了更强的抑瘤作用,并且对正常人的淋巴细胞没有明显毒性。白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。克隆性白血病细胞因为增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积,并浸润其他非造血组织和器官,同时抑制正常造血功能。我国各地区白血病的发病率在各种肿瘤中占第六位,严重威胁人类健康。虽然多种疗法对白血病的治疗有一定疗效,但白血病仍然是一种死亡率很高的疾病,寻找治疗白血病的药物仍然是目前研究者的迫切任务。本课题组对人白血病K562细胞系研究发现,iso-suillin对K562细胞的抑制作用可以通过线粒体途径和死亡受体途径诱导细胞凋亡实现,但其对K562细胞增殖抑制作用的分子机制没有深入了解,本研究在之前研究的基础上继续对iso-suillin抑制K562细胞增殖的分子机制进行深入探索。通过揭示iso-suillin诱导K562细胞增殖抑制的分子机制,寻找对白血病细胞杀伤的关键靶点,为白血病的治疗提供理论基础及可能的药物。方法:1 K562细胞培养K562细胞以DMEM培养基,含10%FBS、1%青链霉素混合液（100×）,置于37℃5%CO₂的饱和湿度培养箱中培养。2基因芯片技术检测iso-suillin对K562细胞全基因体转录谱的影响及生物信息学分析常规培养K562细胞,用终浓度为5.48μM的iso-suillin作用24 h,提取总RNA后进行RNA品质检测,RNA信号放大与荧光标定后,Phalanx One Array TM杂交,影像扫描与数据撷取,对芯片数据进行筛选和校正,计算对照组（C）和加药组（T）荧光讯号的比值,根据log2（ratio）和p-value筛选差异表达基因,差异基因的筛选条件设定为log2|ratio|≥1且p-value<0.05;筛选出对照组和iso-suillin处理组差异表达基因后,差异基因分别进行GO term功能富集分析（包括所处的细胞组分CC、分子功能MF和参与的生物过程BP）和KEGG信号通路富集分析。根据挑选出的差异基因,计算这些差异基因同GO分类中某或几个特定的分支的超几何分布关系,GO分析会对每个有差异基因存在的GO返回一个P值,小的P值表示差异基因在该GO中出现了富集;根据挑选出的差异基因,计算这些差异基因同KEGG pathway的超几何分布关系,pathway分析会对每个有差异基因存在的pathway返回一个P值,小的P值表示差异基因在该pathway中出现了富集。P值越小,-lin（P-value）越大,富集显著性越明显。用-lin（P-value）作饼形图。3 MTT法检测iso-suillin对K562细胞抑制率不同浓度iso-suillin处理K562细胞后,加入5 mg/ml MTT 2-4 h,用DMSO溶解结晶,酶标仪测吸光值,计算抑制率并绘制细胞增殖抑制曲线。4软琼脂克隆形成试验检测iso-suillin对K562细胞克隆形成的影响把处于对数生长期的K562细胞以1×105/ml浓度种于6孔板,用不同终浓度iso-suillin处理K562细胞,37℃5%CO₂培养箱中培养24 h后,以每瓶800个细胞种于12.5 cm²小培养瓶中,待有明显肉眼可见的克隆形成时倒掉培养基,每瓶加入1 ml软琼脂,置冰上冷却凝固,用结晶紫染色5 min,用预冷PBS缓冲液洗2次,拍照,克隆形成计数并测量克隆直径。5流式细胞术检测iso-suillin对K562细胞周期分布的影响把处于对数生长期的K562细胞以1×10⁵/ml浓度种于6孔板,加入不同浓度iso-suillin,置于37℃5%CO₂培养箱中培养24 h后收集细胞。离心弃上清,用预冷PBS缓冲液洗2次,用70%乙醇固定过夜（先用300μl PBS重悬细胞,再缓慢滴加700μl无水乙醇,混匀）,离心收集细胞,预冷PBS洗2次,每个细胞样品加入500μl PI染色工作液（50 ug/ml,含RNA酶）,37℃避光孵育30 min,流式细胞仪上机检测,flowjo7.6.5软件分析各时期细胞分布,计算处于G0/G1、S、G2/M期细胞数目,作直方图。6 Western blot检测iso-suillin对K562细胞增殖相关蛋白表达的影响K562总蛋白提取后,用12%分离胶和4%浓缩胶电泳,0.22μM PVDF膜200 m A恒流湿转1-2 h,5%脱脂奶粉封闭2.5 h,4℃孵育一抗过夜,洗膜3次,孵育二抗37℃1 h,洗膜3次,扫膜,测量条带灰度值。7 K562细胞p53基因突变验证常规方法提取K562总DNA,用引物F-P53 CATCGCTATCTGAGCAG CGCTCA和R-P53 TCTGGGCTTCTTGCATTCTGGGAC进行PCR扩增,样品用1%琼脂糖凝胶100 V 20 min电泳,紫外线下找到对应条带,切胶回收,得到p53基因片段,送武汉擎科测序部做双向测序,在NCBI网站查取p53m RNA CDS序列,用DNAMAN软件进行序列比对。8 P38抑制剂对iso-suillin抑制K562细胞增殖相关因素的影响培养的K562细胞中加入p38抑制剂（SB203580）0.5μM（IC50）预处理30 min后,再用iso-suillin处理K562细胞24 h,按照上述方法进行MTT检测K562细胞增殖抑制率,克隆形成试验检测细胞克隆形成情况,流式细胞术检测细胞周期分布;iso-suillin处理K562细胞3 h,western blot检测相关蛋白表达情况。9统计学方法实验结果用x±s表示,用SPSS 21统计软件对均数作单因素方差分析（One-Way ANOVA）,取P<0.05为有统计学意义。结果:1 Iso-suillin对K562细胞全基因体转录谱的影响及生物信息学分析与对照组（C）相比,用药组（T）差异表达的基因有639个,其中上调443个,下调196个。上调的主要基因有ATF3、GFPT1、S100P、PHGDH、ATP2A3、NRCAM、SESN2、ATF5、LAMP3和LAD1,有多个基因与促凋亡因子相关,如多种肿瘤坏死因子基因（TNFAIP3、TNFRSF9、TNFRSF10B、TNFRSF11B）、DNA损伤诱导转录蛋白基因DDIT4和分化因子GDF15;下调的基因主要有MFAP3、LTNFRSF10B、SH3BP2、RUNDC3B、DIP2C、SLC7A11、WARS、AAK1、ENAH、LPGAT1和EPAS1,且促有丝分裂信号成分RAS相关基因（REM1、RAB15）表达明显降低,可能与iso-suillin对K562细胞的增殖抑制作用有关。进一步的筛选我们发现细胞周期激酶抑制蛋白家族成员CDKN1A（p21）的表达明显上升。Go term功能分析结果显示,差异表达基因的产物主要分布在细胞质、细胞骨架、运输小泡、溶酶体;差异基因的分子功能主要与维生素（辅酶）、酶的结合相关,同时与中性氨基酸跨膜转运有关;差异基因的生物功能主要涉及到细胞凋亡、细胞程序性死亡和丝氨酸家族氨基酸代谢过程。差异基因的KEGG信号通路分析结果显示,有多条信号通路与差异表达的基因相关,根据差异表达基因,我们分别列出了最可能（P值最小）的7条差异基因的KEGG通路:甘氨酸-丝氨酸和苏氨酸代谢、p53信号通路、胰岛素信号转导通路、叶酸的一碳库、丙氨酸-天冬氨酸和谷氨酸代谢、氮素代谢和氨酰t RNA生物合成。P值分别为0.0004、0.0055、0.0105、0.0131、0.016、0.0352和0.0403。-lin（P-value）分别为1.31、0.49、0.41、0.43、0.44、0.25、0.25。差异基因主要在物质代谢相关的信号通途和p53信号通路显著富集。2 MTT检测iso-suillin对K562细胞抑制率K562细胞经1.37、2.74、5.48、10.95μM iso-suillin处理24 h后,抑制率分别为0.28±4.21、0.16±2.59、11.23±8.33、29.32±2.35（%）,组间差异显著。结果表明:iso-suillin对K562细胞有明显抑制,且有浓度依赖性。3软琼脂克隆形成试验检测iso-suillin对K562增殖活性的影响0、2.74、5.48、10.95μM iso-suillin处理K562细胞24 h后,克隆形成率依次为39.08±13.13、25.8±11.91、15.75±5.25、11.67±8.80（%）组间差异显著;克隆大小依次为1.88±0.17、1.88±0.30、1.15±0.07、0.77±0.30（mm）。结果表明:随iso-suillin浓度增加,克隆形成率明显降低且克隆的面积变小。4流式细胞术检测iso-suillin对K562细胞周期分布的影响K562细胞在0、2.74、5.48、10.95μM iso-suillin处理24 h后,G1期细胞占总细胞的比例为48.31±2.52%、60.27±3.67%、61.07±3.59%和67.70±2.19%;S期细胞分别为34.48±1.57%、17.98±3.09%、21.33±5.89%和18.18±7.58%;G2期细胞分别为17.22±1.76%、21.74±0.59%、17.60±2.60%和14.12±5.56%。随着药物浓度的增加G1期细胞所占比例明显增加（P<0.02）;S和G2所占比例下降,有统计学意义。5 Western blot检测iso-suillin对K562细胞增殖相关蛋白表达的影响用0、2.74、5.48、10.95μM iso-suillin处理K562细胞24 h,提取总蛋白,用Western Blot检测细胞增殖相关蛋白的表达和磷酸化情况,结果如下:与内参蛋白β-actin比较,cyclin D相对含量为0.8072±0.0134、0.8098±0.0431、0.7388±0.0594、0.6954±0.0296;CDK4分别为0.0216±0.0003、0.0202±0.0009、0.0095±0.0006、0.0038±0.0004;PCNA为0.1256±0.0027、0.0573±0.0016、0.0505±0.0026、0.0468±0.0013;p-RB1.4254±0.0358、0.7835±0.0485、0.8632±0.0399、0.2117±0.0276;E2F-10.4987±0.0423、0.2754±0.0099、0.2568±0.0119、0.0419±0.0005;p210.0646±0.0032、0.1337±0.0013、0.1286±0.0009、0.1228±0.0019;p380.76410.0149、0.8479±0.0251、0.7765±0.0198、0.8378±0.0667;p38（phospho Thr180/Tyr182）0.1859±0.0025、0.1144±0.0052、0.0982±0.0061、0.0911±0.0113,随iso-suillin浓度的增加K562细胞中增殖相关蛋白cyclin D、CDK4、PCNA和E2F-1的相对含量逐渐减少,且有统计学意义（P<0.05）;细胞周期蛋白依靠性激酶抑制蛋白p21的相对含量明显升高,但p38的磷酸化程度在iso-suillin作用于K562细胞24 h明显降低（P<0.05）。用5.48μM iso-suillin作用于K562细胞0、3、6、12、24 h,提取总蛋白,western测得p-p38相对含量为0.0050±0.0003、0.0411±0.0020、0.0133±0.0005、0.0036±0.0013、0.0103±0.0006;γ-H2AX的相对含量分别为0.0295±0.0032、0.0646±0.0032、0.1337±0.0013、0.1286±0.0009、0.1228±0.0019。结果显示iso-suillin作用于K562细胞后,p38的磷酸化程度先升后降在3 h时最高,γ-H2AX的相对含量逐渐升高在6 h后显著升高。K562细胞中p53基因发生移码突变,在p53蛋白编码区序列（CDS）的406和407位点插入了一个鸟嘌呤核糖核苷酸,导至CDS序列的442-444位点提前出现终止密码子TAG;用western bot无法检测到正常p53蛋白表达,如果p53突变体被表达,其分子量大约15 Kda,但该突变体蛋白未被检测到。7 P38抑制剂处理后iso-suillin对K562细胞抑制率、克隆形成率及细胞周期分布的影响对照组和SB203580、iso-suillin+SB203580、iso-suillin处理组K562细胞的增殖抑制率分别为0、6.02±3.63、20.35±3.78、36.33±15.76（%）;克隆形成率为36.83±4.09、17.33±11.7、7.58±2.48、2.71±1.87（%）。与对照组相比,处理组细胞增殖都受到了不同程度的抑制作用,但SB203580+iso-suillin与iso-suillin处理组细胞相比,SB203580+iso-suillin细胞增殖抑制作用明显减弱,且有统计学意义（P<0.05）。流式细胞术测得对照组和SB203580、iso-suillin+SB203580、iso-suillin处理组K562细胞的周期分布情况:G0/G1所占比例分别为39.26±1.17、43.53±0.97、44.00±1.24、65.22±4.74（%）;S期32.26±2.60、25.14±2.82、26.43±4.21、18.95±3.47（%）;G2期28.47、1.43±31.33、1.86、29.58±2.98、15.83±1.28（%）。与对照组相比,处理组G0/G1期细胞比例都有所增加,但SB203580+iso-suillin与iso-suillin处理组细胞相比,SB203580+iso-suillin组G0/G1期细胞比例明显减少,且有统计学意义（P<0.05）。8 P38抑制剂处理后iso-suillin对K562细胞增殖相关蛋白表达的影响Iso-suillin加药3 h后,对照组和SB203580、iso-suillin+SB203580、iso-suillin处理组K562细胞中相应蛋白表达量为:p21相对含量为0.4984±0.0087、0.3296±0.0603、0.2091±0.0183、1.1401±0.023;p-p38蛋白的相对含量分别为0.3300±0.0052、0.1298±0.0163、0.1298±0.0164、0.1205±0.0054、0.6562±0.0312。发现加入p38抑制剂SB203580后p38磷酸化程度和p21相对含量明显降低;加SB203580后,SB203580+iso-suillin处理组细胞p38磷酸化程度和p21含量相对iso-suillin处理组明显降低,且有统计学意义（P<0.05）。6K562细胞p53基因突变验证结论:1 Iso-suillin能够抑制K562细胞增殖。2 Iso-suillin能够诱导K562细胞G0/G1期周期阻滞。3 Iso-suillin处理K562细胞后,差异表达的基因与p38MAPK信号通路和p53信号通路显著相关。4 Iso-suillin可以通过p38/p21信号通路诱导K562细胞G0/G1周期阻滞。