论文部分内容阅读
背景和目的:鼻咽癌是耳鼻咽喉科常见的一种恶性肿瘤,发生于鼻咽上皮细胞,临床上首选的治疗方法为放射治疗,但其不良反应多,给患者带来极大的困扰,因此,深入研究鼻咽癌的发病机制,寻找新的药物及治疗靶点具有重要的临床意义。非编码RNA(nc RNA)覆盖了98%以上的人类基因组,其中,miRNA为长度在19-23个核苷酸之间的非编码微小RNA,miRNA在癌症的发生及发展过程中发挥着重要作用;长非编码RNA(long non-coding RNAs,lnc RNAs)可参与人类的多种病理生理过程,长链非编码RNA近几年在癌症中的研究日益增多,其功能也得到与miRNA几乎同等地位的肯定。长链非编码RNA癌症易感候选者9(cancer susceptibility candidate 9,CASC9)为近期发现的在部分癌症中发挥调控功能的一种lnc RNA,其在鼻咽癌中的研究甚少,发挥作用的分子机制国内外尚未有人完全清楚。本课题包括以下三部分:第一部分:CASC9基因在鼻咽癌中的表达及临床意义;第二部分:CASC9基因调控鼻咽癌细胞进程的机制研究;第三部分:沉默CASC9基因抑制鼻咽癌肿瘤生长的体内研究。第一部分CASC9基因在鼻咽癌中的表达及临床意义方法:1.通过q RT-PCR的方法检测了鼻咽癌组织和鼻咽癌细胞系HNE1、SUNE1、CNE1、HONE1中CASC9基因的表达水平。2.通过回顾调查分析CASC9基因的表达与鼻咽癌患者总体生存时间的关系。结果:1.鼻咽癌组织中CASC9基因的表达水平明显升高,并且与患者的分期及转移密切相关。2.鼻咽癌四种细胞系中CASC9基因的表达水平明显升高。3.鼻咽癌组织中CASC9基因的高表达与患者的总体存活时间呈负相关。第二部分CASC9基因调控鼻咽癌细胞进程的机制研究方法:1.通过MTT法检测沉默CASC9、回复miR-145后的鼻咽癌细胞的增殖。2.通过Transwell法检测沉默CASC9、回复miR-145后的鼻咽癌细胞的迁移和侵袭。3.通过流式细胞术法检测沉默CASC9、回复miR-145后的鼻咽癌细胞的周期阻滞和凋亡。4.通过Western blot法检测沉默CASC9、回复miR-145后的鼻咽癌细胞中MMP2、MMP9、Bcl-2、Bax的蛋白表达。5.通过生物信息学分析推测CASC9及miR-145的靶基因。6.构建野生和突变型的CASC9的重组质粒和SMAD4的重组质粒,通过双荧光素酶报告实验和RNA免疫共沉淀实验验证CASC9的靶基因和miR-145的靶基因。7.通过q RT-PCR法检测CASC9过表达和敲低后miR-145的表达及miR-145过表达和敲低后SMAD4的表达。结果:1.沉默CASC9可以抑制鼻咽癌细胞的增殖,回复miR-145后可以促进鼻咽癌细胞的增殖。2.沉默CASC9可以抑制鼻咽癌细胞的迁移和侵袭,回复miR-145后可以促进鼻咽癌细胞的迁移和侵袭。3.沉默CASC9可以阻滞鼻咽癌细胞G1期、促进鼻咽癌细胞凋亡,回复miR-145后可以促进鼻咽癌细胞周期、抑制鼻咽癌细胞凋亡。4.沉默CASC9可以抑制迁移侵袭标志蛋白MMP2、MMP9的表达,抑制Bcl-2的表达,促进Bax的表达。5.生物信息学预测显示miR-145为CASC9的靶基因,SMAD4为miR-145的靶基因。6.双荧光素酶报告基因和RNA免疫共沉淀实验验证miR-145为CASC9的靶位基因,SMAD4为miR-145的靶基因。7.CASC9基因负向调控miR-145的表达,miR-145负向调控SMAD4基因的表达。第三部分沉默CASC9基因抑制鼻咽癌肿瘤生长的体内研究方法:1.通过慢病毒构建沉默CASC9基因的鼻咽癌细胞CNE1。2.通过裸鼠成瘤实验检测沉默CASC9基因对肿瘤生长的影响。3.通过q RT-PCR的方法检测沉默CASC9基因对肿瘤中miR-145、SMAD4表达的影响。4.通过Western blot法检测肿瘤中MMP2、MMP9、Bcl-2、Bax的表达。结果:1.成功构建慢病毒介导的CASC9基因沉默的CNE1细胞。2.沉默CASC9基因可以抑制裸鼠体内肿瘤的生长。3.沉默CASC9基因可以抑制肿瘤中迁移侵袭标志蛋白MMP2、MMP9的表达,抑制Bcl-2的表达,促进Bax的表达。结论:1.CASC9基因在鼻咽癌中高表达,且与鼻咽癌的分期、预后相关。2.CASC9基因可通过miR-145/SMAD4通路调控鼻咽癌细胞的增殖、迁移、侵袭、细胞周期及凋亡。3.CASC9基因可在裸鼠体内通过调控miR-145、SMAD4的表达进而调控肿瘤的生长。