食管癌是人类常见的恶性肿瘤之一。由于缺乏有效的早期诊断方法,大多数食管鳞癌患者在确诊时已为中晚期并预后不良。故寻找有效的早期诊断方法已成为肿瘤研究的热点。MiRNAs是一类可通过抑制其特异性靶基因表达从而调控食管鳞癌发生发展的非编码内源性小RNA。本研究首先通过分析多个实验室的血清miRNAs芯片结果,且基于已有的研究报道筛选了4种miRNAs(miR-25-3p、miR-223-3p、miR-373-3p和miR-483-5p),其次,通过RT-qPCR方法检测了4种miRNAs在食管鳞癌患者血清和组织中的表达水平、miR-483-5p作用的相关基因的表达水平,并通过MSP法检测了相关基因的甲基化程度,来初步探究4种miRNAs在食管鳞癌中的表达及miR-483-5p的分子调控机制,研究结果如下:1、对食管鳞癌患者和健康志愿者血清中4种血清miRNAs表达水平分析,发现miR-25-3p、miR-223-3p、miR-373-3p和miR-483-5p在食管鳞癌血清中高表达(p﹤0.01)。用ROC曲线评估4种血清miRNAs对于食管鳞癌的诊断价值,结果显示,4种miRNAs的AUC值分别为0.794(95%CI:0.659-0.928;灵敏度为81.0%;特异性为66.7%)、0.839(95%CI:0.717-0.961;灵敏度为100.0%;特异性为61.9%)、0.873(95%CI:0.763-0.983;灵敏度为90.5%;特异性为81.0%)、0.927(95%CI:0.850-1.000;灵敏度为95.2%;特异性为81.0%)。此外,血清miR-483-5p的表达水平与患者的病理分期(p﹤0.05)、淋巴结转移(p﹤0.05)相关。4种血清miRNAs在手术切除癌组织后显著下降(p﹤0.01)。结果表明,这些血清miRNAs可用于食管鳞癌的早期诊断,并具有较高的灵敏度和特异性。本实验还采用了测序技术检测食管鳞癌患者血清和组织中miR-25-3p、miR-223-3p、miR-373-3p和miR-483-5p的茎环引物PCR扩增产物,比对结果显示,茎环引物PCR方法是可行的。对食管鳞癌患者癌组织和癌旁组织中4种miRNAs表达水平分析,发现miR-25-3p、miR-223-3p、miR-373-3p和miR-483-5p在癌组织中高表达,并具有显著性差异(p﹤0.01)。因此,血清中4种miRNAs主要来源于食管鳞癌组织。2、以上实验结果表明,miR-483-5p具有较高的灵敏度和特异性,对食管鳞癌的诊断具有较高诊断价值,故进一步研究了miR-483-5p的调控机制。对miR-483-5p进行生物信息学预测分析,推测出miR-483-5p可作用于Rho GDI1、Socs3和ALCAM基因的3’UTR,因此,本研究采用RT-qPCR技术对食管鳞癌患者组织中Rho GDI1、Socs3和ALCAM基因的mRNAs表达水平检测,发现患者癌组织中Rho GDI1、Socs3和ALCAM基因的表达水平下调,且与miR-483-5p表达呈负相关,结果初步表明,高表达的miR-483-5p可以抑制Rho GDI1、Socs3和ALCAM基因的表达。3、据报道miR-483-5p由IGF2基因第二个内含子编码,RT-qPCR结果表明,IGF2基因在食管鳞癌患者癌组织中高表达,其表达水平与miR-483-5p表达呈正相关,且具有统计学意义(p﹤0.05),高表达的miR-483-5p与其宿主基因IGF2“共表达”。为了探究食管鳞癌中相关基因的甲基化调控机理,本研究检测了食管鳞癌患者中CDKN2A基因和IGF2基因的启动子区甲基化程度,发现81.82%的患者中CDKN2A基因倾向于高甲基化。54.55%的患者中IGF2基因倾向于低甲基化。IGF2基因启动子区低甲基化患者中miR-483-5p表达水平较高,实验结果初步表明,IGF2基因启动子低甲基化可诱导miR-483-5p高表达。综上所述,本实验结果综合分析解释了miR-483-5p在食管鳞癌发病机理中的可能作用,即通过IGF2基因启动子区低甲基化表观遗传学修饰,导致miR-483-5p和IGF2的高表达,从而加速Rho GDI1、ALCAM和Socs3基因的mRNAs降解,促使食管鳞癌组织的促癌因子增强,抑癌因子降低,进而导致肿瘤的发生发展。IGF2和CDKN2A基因的启动子区甲基化程度改变,说明表观遗传学修饰在食管鳞癌发病机理中也起着重要作用。本文为深入研究miRNAs在食管鳞癌中的作用机理打下基础。