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背景肾移植被公认为治疗终末期肾病的最佳方式,每年全世界有数万计的尿毒症患者进行肾移植手术。肾移植术后急、慢性排斥反应以及各种原因引起的慢性移植肾病是临床上制约移植肾长期存活的关键因素。目前研究认为诱导机体对于移植肾的免疫耐受是解决上述问题的最理想方式。骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchyme stem cells,BM-MSCs)由于具有独特的免疫调节作用及多向分化潜能,被认为是诱导免疫耐受、减轻及修复移植肾免疫损伤的理想工具。但是应用到动物模型中后,研究发现BM-MSCs在体的免疫抑制效应偏弱,在肾移植模型中应用时并不能明显减少免疫抑制剂的应用。并且由于缺乏向移植肾的靶向机制以及肺、肝等静脉池的滞留效应,BM-MSCs输注体内之后,只有极少数能够到达移植肾部位,无法在局部发挥免疫保护、组织修复等效应。因此,迫切需要研究如何提高BM-MSCs本身的免疫抑制效应以及增加在移植肾局部的聚集,以缩小BM-MSCs从基础研究到肾移植临床应用的距离。目的本研究拟通过慢病毒载体将具有明确免疫抑制效应的HLA-G基因转染到BM-MSCs中,观察能否使其细胞表面大量表达HLA-G分子,并在体外验证其免疫抑制效应是否得到增强。为使转染HLA-G后输注到体内的BM-MSCs能够聚集在移植肾局部发挥效应,本研究拟使BM-MSCs吞噬超顺磁纳米铁颗粒(Super-paramagnetic iron oxide,SPIO)后带有磁性,在移植肾局部应用强磁场,观察能否使BM-MSCs在移植肾局部聚集并发挥免疫抑制效应。本研究拟为BM-MSCs在肾移植领域的应用提供一种新思路。方法1、穿刺兔股骨获得骨髓,使用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞。应用贴壁培养法获得BM-MSCs。诱导向成骨、成脂细胞方向分化。流式细胞术鉴定BM-MSCs表面分子标志。2、化学合成HLA-G基因,PCR扩充,与慢病毒载体一起进行酶切及连接,行Real-time PCR鉴定和测序,构建HLA-G慢病毒表达质粒。转染293T细胞后收集含病毒上清后浓缩,Real-time PCR测定病毒滴度。携带HLA-G的慢病毒载体感染BM-MSCs,观察绿色荧光表达,获取最合适的MOI值。WB法检测细胞膜型HLA-G表达水平。ELISA法检测上清中分泌型HLA-G水平。3、建立混合淋巴细胞培养体系,通过BM-MSCs与淋巴细胞共培养,验证转染了HLA-G的BM-MSCs(之后描述为HLA-G-BM-MSCs)的功能学效应特点。应用免疫磁珠从培养体系中分离出CD4+T细胞,检测其凋亡情况,并通过WB法检测其细胞周期相关蛋白的表达。4、应用SPIO孵育HLA-G-BM-MSCs,使其带有磁性。建立兔同种异体肾移植模型,在移植肾部位安放体外强磁场,形成磁场的趋化。将吞噬了SPIO的BM-MSCs输注体内,病理切片观察BM-MSCs能否更多地聚集到移植肾。观察与环孢素相比,其免疫抑制效应如何。结果1、密度梯度离心及贴壁培养法成功分离培养出兔BM-MSCs。细胞生长旺盛,可连续传代15次以上,形态呈典型梭状,漩涡状生长。在成骨、成脂诱导下,能够成功分化为成骨及成脂细胞。流式细胞BM-MSCs表面抗原示CD90表达阳性,CD14表达阴性。2、成功构建携带HLA-G基因的慢病毒转染体系,病毒滴度达到2x109TU/ml。携带HLA-G的慢病毒成功感染BM-MSCs,确定最佳MOI值为50。转染后绿色荧光表达强,传代10次以上仍然可以稳定表达绿色荧光。WB显示BM-MSCs大量表达HLA-G分子。ELISA法显示BM-MSCs并不产生分泌型的HLA-G。3、成功建立兔BM-MSCs与人PBMC的Transwell共培养体系。结果显示HLA-G-BM-MSCs能够明显抑制淋巴细胞增殖反应,抑制率达到61.2%。这种抑制效应是在与淋巴细胞发生接触时产生的,Transwell上室中未与HLA-G-BM-MSCs发生接触的淋巴细胞增殖不受抑制。凋亡检测显示共培养体系中的CD4+T细胞并没有出现明显凋亡,而是停留在G0/G1期,未能进入增殖期,WB检测显示相关的细胞周期蛋白cyclin D2、cyclin D3以及CDK等表达明显减少。4、成功使HLA-G-BM-MSCs吞噬SPIO,吞噬后细胞形态、增殖能力等不受影响。电镜显示细胞内溶酶体中大量铁颗粒存在。荧光显微镜示发绿色荧光的BM-MSCs内部含有大量红色荧光的SPIO颗粒。在体外BM-MSCs能够在强磁场中发生定向运动。输注体内之后,应用移植肾局部的外在强磁场能够使更多的BM-MSCs聚集到肾脏部位。其免疫抑制效应明显增强,稍弱于环孢素应用的效果,但是明显强于不施加磁靶向的组别。结论1、密度梯度离心加贴壁培养法获得兔BM-MSCs,经分化鉴定及流式鉴定符合BM-MSCs标准。2、应用慢病毒载体将HLA-G基因转染至BM-MSCs细胞,HLA-G基因能够正确、稳定地转录和表达。3、体外实验中,HLA-G-BM-MSCs能够通过与淋巴细胞的直接接触抑制其增殖。其抑制CD4+T细胞增殖的机制不是诱导其发生凋亡,而是通过抑制相关细胞周期蛋白cyclin D2、D3及相关激酶CDK4、6的表达实现的。4、在体实验中,磁靶向能够使孵育了SPIO的HLA-G-BM-MSCs更多地聚集到移植肾,使其免疫抑制效应明显增强,从而减轻移植肾的免疫损伤,促进肾移植术后功能恢复。