缺血性脑卒中是一种脑血管性疾病,对人类健康具有重大威胁。近几年该疾病的发病率无论在发达国家还是发展中国家均呈现逐渐提高的趋势,其较高的死亡率和难以控制的致残率不容忽视。目前在临床上主要采用介入溶栓的方式来治疗该疾病,尽管效果显著,但该治疗手段对于患者有着较为严格的适应症要求,并非所有患者均能得到有效的救治,且大部分患者则由此进入脑卒中长期迁延阶段,预后不佳。与此同时,目前临床上应用药物治疗缺血性脑卒中时多以西药为主,这些药物对于处于长期预后阶段的缺血性脑卒中患者的疗效不尽如人意,且同时伴有较多的不良反应。在近些年的研究中,人们发现中药对治疗脑卒中尤其是急性缺血性脑卒中具有较好的效果,且总体副作用较小;然而遗憾的是,鲜有研究详细阐述中药发挥保护作用的机制,且这些课题多围绕急性脑缺血中药的短期治疗开展研究,而对中药在缺血性脑卒中发生后发挥的长期保护作用缺乏足够证据。因此,研发一种可对缺血性脑卒中患者提供长期保护作用的药物依旧是临床应用中迫切需要解决的重大课题。红花（Carthami Flos）是我国传统中药中具有典型活血化瘀作用的一种中药,蕴含了多种生物活性物质,其中菸花苷作为红花中黄酮类化合物家族中的一员受到了我们的关注。课题组前期已经对菸花苷在急性脑梗死动物模型中发挥的作用进行了深入研究,实验结果证明,在发生急性脑梗死损伤后,应用菸花苷试剂可以在大鼠体内发挥有效的保护作用。本论文进一步研究菸花苷长期给药对缺血性脑卒中的保护作用,旨在进一步确认菸花苷对脑卒中的长期保护作用,为菸花苷应用于脑卒中的预后提供科学依据。首先在实验动物上,为模拟临床上缺血性脑卒中发生后的长期预后阶段,采用大脑中动脉阻断法（middle cerebral artery occlusion,MCAO）建立为期8周的大鼠脑缺血再灌注损伤模型,随后观察菸花苷对大鼠8周内生存率和体重变化的影响。在神经行为学层面,通过平衡木实验和悬尾偏转实验检测实验动物的运动平衡能力,通过水迷宫实验评估菸花苷对缺血性脑卒中大鼠学习记忆能力的影响,同时,通过尼氏染色和免疫荧光染色观察第8周大鼠大脑海马区神经元的形态功能和结构。结果表明,菸花苷能够提高脑缺血再灌注损伤大鼠8周内生存率,应用菸花苷后大鼠的生存率提高了33.3%,且菸花苷组于第9天开始不再有大鼠死亡,而模型组则直到第13天才不再新增死亡个例。与此同时,菸花苷组大鼠在术后第一周即开始出现体重增长的趋势,而模型组大鼠则需要2周时间才能恢复体重的缓慢增长,表明菸花苷组较模型组能够更快地恢复体重增长,且体重数值在各观察时间点均显著高于模型组（P＜0.05）。在神经行为学方面,菸花苷组大鼠对侧偏转率随着时间推移逐渐接近50%,双侧肌力趋向对称,行为逐渐协调,运动能力得到显著提升。同时在平衡木实验中菸花苷组大鼠在长期预后阶段得分显著低于模型组（P＜0.01）,出现滑步的路程小于50%,躯体平衡能力得到显著改善。此外,水迷宫实验结果显示,注射菸花苷试剂的大鼠在缺血性脑卒中发生后的长期预后阶段,潜伏期要短于模型组大鼠,其差异具有显著性（P＜0.05）,而在时间更长的第8周,穿台次数则更是明显多于模型组（P＜0.01）,且与假手术组无明显差异,同时实验结果所呈现的搜寻轨迹图使我们更直观地看到,相比于模型组杂乱无章的搜寻方式,菸花苷组大鼠能够通过直线式和趋向式相结合的搜索模式寻找隐藏站台,这一模式更接近于正常大鼠,提示菸花苷可以使因脑缺血再灌注损伤导致的神经功能受损的大鼠学习和记忆能力得到较好的提升。此外,菸花苷还能够改善第8周大鼠大脑海马区神经元的形态功能,具体表现为保持受损神经元细胞的结构完整性,并使之排列更为有序。与此同时,菸花苷亦可提高微管相关蛋白DCX和中间丝蛋白Nestin在神经元细胞质中的阳性表达。前者与神经细胞迁移分化密不可分,后者则事关神经细胞的再生。由此即可进一步促进神经细胞的增殖分化和迁移,使脑组织在受到缺血再灌注损伤后较长的一段时间内依然保持在相对健康良好的状态。其次,为进一步分析菸花苷对大鼠脑缺血再灌注损伤后相关基因表达造成的影响,采用转录组基因测序的手段进行各组之间的比对。结果表明,相比于模型组,菸花苷组有1546个基因存在显著性差异。这些基因与细胞程序性死亡、炎症反应和应激等通路密切相关。在这些基因中发现菸花苷可以显著下调细胞焦亡和炎症反应相关基因GSDMD、Caspase4、IL-18、NLRP3等的表达,其中,GSDMD在脑缺血再灌注损伤发生后,表达水平由2.105提高到了13.530,而在应用菸花苷后显著下调至3.460（P＜0.01）,Caspase4由11.560下调至2.370,下降近5倍（P＜0.01）,IL-18则由13.250下调至2.865（P＜0.05）。提示菸花苷可能在调控上述炎症反应和细胞焦亡通路中发挥了重要作用,为后续的进一步研究奠定了基础。第三,为进一步探索菸花苷的长期保护作用机制,我们初步研究了菸花苷的脑保护作用与细胞焦亡之间的关系,在蛋白质水平上,采用Western-Blot,ELISA等方法检测了细胞焦亡相关蛋白GSDMD、Caspase1、IL-1β、IL-18的表达水平,结果表明,菸花苷可以显著抑制焦亡关键蛋白GSDMD的表达（P＜0.01）,但对调节Caspase1、IL-1β、IL-18蛋白的表达水平并没有表现出突出的作用（P＞0.05）。初步判断菸花苷发挥其长期保护作用的机制可能与抑制细胞焦亡进程有关,它可以通过下调GSDMD基因表达,并抑制其在蛋白质层面的表达来干预这一过程。而Caspase1等阴性结果则提示我们,在体内环境中,菸花苷在影响细胞焦亡过程中其具体的作用方式尚无法明确,需进一步实验加以验证。综上所述,菸花苷可在脑缺血再灌注损伤的大鼠体内产生长期保护作用,且效果显著。其可在较长的时间内改善缺血性脑卒中大鼠的运动平衡能力以及学习记忆能力,使受损的神经元细胞在长期预后阶段依然保持相对完整的状态以维持相应的神经功能;与此同时,菸花苷可以通过下调细胞焦亡关键基因GSDMD的表达并抑制其蛋白水平的表达,进而延缓细胞焦亡的进程来发挥保护作用。本研究结果为菸花苷应用于缺血性脑卒中的长期保护提供了一定依据。