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背景肺癌是目前中国乃至全世界发病率和死亡率最高的癌症,无数科研人员致力于研究肺癌的预防和治疗。研究表明在肺癌细胞中NOX(NADPH氧化酶)家族中的NOX1和NOX4表达升高。NOX家族是机体内产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)的主要来源,在很多肿瘤发生过程中均伴有ROS水平产生的变化,如:胰腺癌,大肠癌,非小细胞肺癌等。NOX家族在肿瘤的发生过程中起着重要作用,其中NOX4可能参与肿瘤细胞的转移过程,而造成肺癌病人死亡的主要原因是肺癌的转移。因此研究NOX4对A549细胞迁移的影响对肺癌的机制研究具有重要意义。上皮间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)是上皮细胞在形态学上发生向间充质细胞转变,并获得迁移的能力,EMT是胚胎发育的一个基本过程,它使在特殊部位产生的上皮细胞从上皮组织分离并转化到其他的组织上,是正常发育、伤口愈合和恶性肿瘤发生的基础。在肿瘤的恶性转变进程中,EMT使得肿瘤细胞获得了迁移和恶变的能力,在各个病理分期的肿瘤细胞均可见到EMT过程。其中TGF-β是肿瘤细胞发生EMT过程的重要调节因子,同时TGF-β可通过NADPH氧化酶产生ROS,而ROS在细胞内的积累对于TGF-β信号传导通路又能起到调节作用。为了探讨NOX4是否通过TGF-β介导的EMT影响A549细胞的迁移,为肺癌的靶向治疗提供理论基础,实验首先采用不同浓度的TGF-β刺激A549细胞,观察细胞内ROS水平的变化及细胞内NOX表达的变化,并用划痕实验观察A549细胞迁移的变化。再采用DPI抑制NOX的表达,同时TGF-β刺激A549细胞,观察观察细胞内ROS水平和NOX表达变化以及细胞的迁移的变化,同时western blot检测EMT相关蛋白snail和E-cadherin的变化。方法1实验方法1.1实验分组:TGF-β刺激浓度选择:分别设置TGF-β刺激浓度为1、0ng/ml;2、2.5ng/ml;3、5ng/ml;4、10ng/ml。然后选择一个合适的TGF-β浓度刺激a549细胞,实验分组如下:1、tgf-β刺激组;2、正常对照组(空白对照);3、dpi组(nox抑制剂组);4、tgf-β+dpi组;5、dmso组(溶剂对照组)。1.2a549细胞迁移的改变,采用细胞划痕实验来检测,根据细胞划痕实验的愈合率来表示细胞的迁移率。1.3细胞内ros的测定:细胞相应处理24h后,用dcfh-da标记20min,然后用流式细胞仪检测ros表达的荧光值,根据荧光值的强弱表示ros表达水平的高低。1.4mrna水平的检测,提取出细胞内的rna后用微量核酸测定仪检测rna纯度、琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性后,逆转录为cdna进行pcr或荧光定量pcr。1.5nox1、nox4、snail、e-cadherin蛋白水平的检测:将提取的蛋白质检测其浓度和纯度后,采用westernblot方法检测蛋白表达水平。2统计方法:采用spss21.0对实验结果数据进行统计学分析,采用单因素方差分析比较三组的均数之间的差异,两两比较采用lsd法或dunnett法。两变量关联性分析选取检测pearson相关系数,检验水准取α=0.05。结果1.不同浓度的tgf-β刺激a549细胞,随着tgf-β浓度的升高,划痕实验的愈合率增高,a549细胞的迁移能力增强(p<0.001)。流式细胞仪检测ros的荧光量升高,说明细胞内ros表达水平上升(p<0.001);与nox1相比nox4蛋白的mrna和蛋白的表达水平均升高(p<0.001),且nox4的表达与ros水平升高趋势相同。2.加入nox4抑制剂dpi后,dpi组组正常对照组相比nox4mrna和蛋白表达水平均明显下降,统计学检测差异具有统计学意义(p<0.001);tgf-β+dpi组与tgf-β组相比nox4mrna和蛋白表达水平也均明显下降,统计学检测差异具有统计学意义(p<0.001),说明dpi成功的抑制了a549细胞内nox4的表达。3.nox4被抑制后,正常对照组与dmso组相比无差异,统计分析差异无统计学意义(p>0.05);dpi组与正常对照组相比,tgf-β+dpi组与tgf-β组相比,ros水平明显降低,统计结果显示差异有统计学意义(p<0.001)。4.划痕结果显示,dpi组与正常对照组相比,tgf-β+dpi组与tgf-β组相比,划痕愈合率降低,说明dpi可以抑制由tgf-β诱导的a549细胞的迁移。5.snail和E-cadherin蛋白的变化:DMSO组和正常对照组无差异,TGF-β组与DMSO组相比,snail表达上升,E-cadherin表达下降;DPI组与DMSO组相比,TGF-β+DPI组与TGF-β组相比,snail表达降低,E-cadherin表达升高。6.细胞形态学显示,正常对照组和DMSO组相比形态学无差异,TGF-β组刺激的细胞形态学上相比正常对照组和DMSO组细胞间粘连变低,细胞变的更加的细长,趋向于间充质细胞的形态,而加入TGF-β+DPI后的A549细胞和TGF-β组相比细胞的形态,由TGF-β刺激诱发的细胞形态的变化不再明显结论NOX4可以通过EMT途径促进A549细胞的迁移,具体机制可能是NOX4促进snail的表达,进而抑制E-cadherin的表达,诱导EMT的发生。