目的:当归为临床常用药,阿魏酸是鉴别当归质量优劣的主要指示性指标之一。钾素是植物体内60多种酶的活化剂,钾素的适量施用对作物的生长、产量及品质等均有积极影响。多年来,国内外关于当归资源评价、生理特性、栽培育种、药理药化以及活性成分的分离提取等方面的研究已有大量报道,但基于与活性成分合成相关的功能基因的分子生物学和营养调控的研究,国内外还鲜有报道。本研究旨在通过对当归阿魏酸生物合成中重要基因咖啡酸-O-甲基转移酶基因(COMT)、4-香豆酸辅酶A连接酶基因(4CL)和阿魏酸-5-羟基化酶基因(F5H)的克隆和表达进行初步分析,并进行钾素营养调控,为探索当归阿魏酸生物合成途径的分子机制和营养调控效应奠定基础,为阐述当归品质形成的营养调控机制提供理论依据。方法:参考Genbank已发表的植物COMT、4CL、F5H基因保守序列设计一对简并引物,以当归叶片总RNA为模板,采用反转录PCR(RT-PCR)法克隆出COMT、4CL和F5H基因核心片段后测序;以核心片段序列设计基因特异性引物,利用c DNA末端快速扩增(RACE)法克隆出COMT和F5H基因两翼序列;将核心序列和两翼序列进行电子拼接,设计基因全长扩增引物,扩增出全长c DNA序列,并进行测序,在Genbank中注册。运用SYBR Green荧光定量PCR方法,以当归18S基因为内参照基因,检测COMT、4CL和F5H基因在当归不同组织,不同时期和不同钾素处理中的表达量。结果:(1)当归咖啡酸-O-甲基转移酶基因(COMT)全长的克隆及序列分析(登录号:KP188587):利用RT-PCR和RACE技术,得到了当归咖啡酸-O-甲基转移酶基因(COMT)全长,该基因c DNA序列长度为1436 bp,含有1个1098 bp的完整开放阅读框,编码365个氨基酸。与NCBI核酸和蛋白数据库中其他7种COMT基因的序列进行比对,结果序列相似性较高(75%以上)。(2)当归4-香豆酸辅酶A连接酶基因(4CL)核心片段的克隆及序列分析:利用RT-PCR技术,得到了当归4-香豆酸辅酶A连接酶基因(4CL)核心片段,该基因片段c DNA序列长度为514 bp,编码170个氨基酸。与NCBI核酸和蛋白数据库中其他7种4CL基因的序列进行比对,结果显示序列相似性较高(79%以上)。(3)当归阿魏酸-5-羟基化酶基因(F5H)全长的克隆及序列分析(登录号:KP257433):利用RT-PCR和RACE技术,得到了当归阿魏酸-5-羟基化酶基因(F5H)全长,该基因c DNA序列长度为1839 bp,含有1个1539 bp的完整开放阅读框,编码512个氨基酸。与NCBI核酸和蛋白数据库中其他7种F5H基因的序列进行比对,结果显示序列相似性较高(70%以上)。(4)不同钾素水平对COMT、4CL和F5H基因表达的影响:荧光定量PCR结果表明三个基因随着时间的延长相对表达量均逐渐增高。COMT基因在前期根系表达量高于茎叶,但后期茎叶相对表达量增高并超过根系;在茎叶和根系中0mmol/L K+处理对COMT的表达均有显著地抑制作用。4CL基因在前期根系表达量高于茎叶,但后期茎叶相对表达量增高并超过根系;且在茎叶中0 mmol/L K+处理和12.0 mmol/L K+处理均会抑制这种基因的表达。F5H基因在茎叶的表达量要显著高于根系表达量;在茎叶中,前期0 mmol/L K+处理和12.0 mmol/L K+处理均对F5H的表达表现出一定的抑制性,后期12.0 mmol/L K+处理的抑制性降低,但0 mmol/L K+处理仍表现出显著地抑制性,在根系中,12.0 mmol/L K+处理对F5H的表达表现出显著地抑制性。结论:(1)成功克隆出了当归COMT基因、F5H基因的全长以及4CL基因的核心片段,并在Genbank中注册,当归COMT全基因的登录号为KP188587,当归F5H全基因的登录号为KP257433;(2)通过研究钾素水平对当归阿魏酸生物合成相关基因表达的影响表明,6.0 mmol/L K+处理无论在当归幼苗茎叶中还是在根系中均会对当归COMT、4CL和F5H基因的表达产生促进作用,可能更适于当归幼苗的生长,但不一定有利于阿魏酸的积累。