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一、课题背景肺癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率位居男性恶性肿瘤之首,男女总体死亡率亦位于首位,男女总体发病率仅次于乳腺癌。放射治疗是肺癌的重要治疗策略。放射治疗在初期对肺癌有较好的疗效,但随着治疗的进展,临床上有部分患者对放射治疗抵抗,造成肺癌局部控制不佳或肺癌复发,进而导致治疗失败。因此寻找有效的肺癌放射治疗增敏新靶点成为亟待解决的重要科学问题。肿瘤细胞的放射治疗敏感性与细胞氧合、细胞周期、增殖活性、DNA损伤修复等诸多因素有关,其中肿瘤细胞DNA损伤修复能力的增强是引起放射治疗抵抗的重要原因。电离辐射的主要靶标为DNA,通过诱导DNA损伤和阻断DNA修复过程,对肿瘤细胞发挥细胞毒性作用,从而阻滞细胞周期,促进细胞凋亡。研究显示,长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）在DNA损伤修复的启动中发挥着必不可少的作用,为从lncRNA的角度阐释DNA损伤修复乃至肿瘤放射治疗抵抗的分子机制提出了新思路。大量研究表明,lncRNA可以通过调控DNA损伤修复参与肿瘤放射治疗抵抗,但大多数关于lncRNA在DNA损伤修复及放射治疗抵抗中的作用尚缺乏全面的研究和功能阐释,其调控机制仍不清楚。我们在前期研究中筛选出了电离辐射诱导的lncRNA ANRIL,发现ANRIL在肺癌细胞电离辐射敏感性中发挥了重要作用,并且与其调节DNA损伤修复密切相关。本研究拟在前期工作基础上,利用I-Sce1-NHEJ/HR报告系统、RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP）、RNA-pull down等方法,全面揭示ANRIL对肺癌细胞电离辐射后DNA损伤修复能力的影响,尤其是对同源重组（Homologous recombination,HR）修复通路中关键分子的调控作用;并构建小鼠肺癌荷瘤模型,在体内实验中进一步验证ANRIL对肺癌细胞电离辐射敏感性及DNA损伤修复的影响;最后,鉴定出ANRIL结合蛋白及与其结合的确切功能域,深入挖掘ANRIL调控HR修复的确切分子机制。本研究将从lncRNA角度为肺癌细胞电离辐射敏感性研究提供新思路。二、研究内容及方法（一）ANRIL对肺癌细胞电离辐射后同源重组修复的影响1、ANRIL在肺癌细胞中的表达水平及其对电离辐射诱导的DNA损伤的影响（1）ANRIL在肺癌细胞中的表达水平（1）检索TCGA数据库中肺癌组织样本和正常肺组织样本的ANRIL表达水平差异;（2）选取临床非小细胞肺癌样本,通过实时荧光定量PCR检测肺癌组织和邻近正常肺组织中ANRIL的表达水平差异;（3）肺癌细胞经过放线菌素D处理以阻断新生RNA的合成,在处理后不同时间点通过实时荧光定量PCR检测肺癌细胞中ANRIL的表达水平变化,以判断ANRIL在肺癌细胞中的半衰期。（2）ANRIL对肺癌细胞电离辐射诱导的DNA损伤的影响（1）选取不同肺癌细胞系,通过慢病毒包装质粒系统构建ANRIL敲低（KD）和ANRIL过表达（OE）稳转细胞系,通过实时荧光定量PCR验证ANRIL敲低和过表达效率;（2）通过免疫荧光染色在共聚焦显微镜下观察ANRIL敲低或过表达对肺癌细胞电离辐射后不同时间点γ-H2AX foci形成情况的影响。2、ANRIL对肺癌细胞电离辐射后非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）修复及其下游信号通路的影响（1）通过I-Sce1-NHEJ和HR报告系统检测ANRIL敲低对肺癌细胞电离辐射后非同源末端连接（Nonhomologous end-joining,NHEJ）和同源重组（Homologous recombination,HR）修复效率的影响;（2）通过Western Blot检测ANRIL敲低或过表达对肺癌细胞电离辐射后不同时间点NHEJ和HR修复下游信号通路的影响;（3）通过免疫荧光染色在共聚焦显微镜下观察ANRIL敲低或过表达对肺癌细胞电离辐射后HR修复关键分子ATR和RPA2 foci形成情况的影响;（4）通过RNA测序分析ANRIL敲低对肺癌细胞电离辐射后DNA损伤应答相关信号通路基因表达的影响。3、ANRIL对肺癌荷瘤模型电离辐射敏感性及HR修复的影响（1）ANRIL敲低对肺癌荷瘤模型电离辐射敏感性及HR修复的影响（1）构建ANRIL敲低肺癌细胞裸鼠皮下荷瘤模型;（2）通过测量肿瘤生长曲线、肿瘤重量及肿瘤Ki67免疫组化染色,评估ANRIL敲低对肿瘤电离辐射后生长增殖能力的影响;（3）通过对肺癌荷瘤组织TUNEL染色,评估ANRIL敲低对肿瘤电离辐射后原位凋亡的影响;（4）通过对肺癌荷瘤组织γ-H2AX免疫组化染色,评估ANRIL敲低对肿瘤电离辐射后DNA损伤的影响;（5）通过对肺癌荷瘤组织ATR、RPA2、Rad51免疫组化染色,评估ANRIL敲低对肿瘤电离辐射后HR修复的影响。（2）ANRIL过表达对肺癌荷瘤模型电离辐射敏感性的影响（1）构建ANRIL过表达肺癌细胞裸鼠皮下荷瘤模型;（2）通过测量肿瘤生长曲线、肿瘤重量及肿瘤Ki67免疫组化染色,评估ANRIL过表达对肿瘤电离辐射后生长增殖能力的影响。（二）ANRIL结合ATR并调控其蛋白稳定性的分子机制1、ANRIL与ATR蛋白相互作用研究（1）通过RNA-pull down检测ANRIL与ATR蛋白结合;（2）通过RIP验证ANRIL与ATR蛋白结合,并探讨ATR磷酸化水平对二者结合的影响;（3）构建ATR不同截断体,通过RIP检测ANRIL结合ATR的确切功能域;（4）通过RNA Fold Web Server在线软件预测ANRIL的二级结构并生成功能区的不同片段,通过RNA-pull down检测与ATR结合的确切ANRIL片段。2、ANRIL调控ATR蛋白稳定性的分子机制（1）ANRIL敲低对肺癌细胞电离辐射后ATR蛋白稳定性的影响,ATR抑制剂（VE821）预处理对肺癌细胞电离辐射后ANRIL表达水平的影响;（2）ANRIL敲低对肺癌细胞电离辐射后ATR m RNA表达水平的影响;（3）蛋白酶体抑制剂（MG132）预处理阻断蛋白泛素化后,ANRIL敲低对肺癌细胞电离辐射后ATR蛋白稳定性的影响;（4）通过ATR特异性抗体免疫沉淀检测ANRIL敲低对肺癌细胞电离辐射后ATR泛素化水平的影响。3、ANRIL敲低细胞中过表达ATR对肺癌细胞电离辐射敏感性的影响（1）构建ANRIL敲低肺癌细胞中过表达ATR的细胞系,并用蛋白质免疫印迹验证ATR的过表达效率;（2）通过克隆形成率评估ANRIL敲低肺癌细胞中过表达ATR对肺癌细胞电离辐射后增殖能力的影响;（3）通过免疫荧光染色在共聚焦显微镜下观察ANRIL敲低肺癌细胞中过表达ATR对肺癌细胞电离辐射后γ-H2AX foci形成情况的影响。4、ANRIL过表达细胞中敲低ATR对肺癌细胞电离辐射敏感性的影响（1）构建ANRIL过表达肺癌细胞中敲低ATR的细胞系,并用蛋白质免疫印迹验证ATR的敲低效率;（2）通过克隆形成率评估ANRIL过表达肺癌细胞中敲低ATR对肺癌细胞电离辐射后增殖能力的影响;（3）通过免疫荧光染色在共聚焦显微镜下观察ANRIL过表达肺癌细胞中敲低ATR对肺癌细胞电离辐射后γ-H2AX foci形成情况的影响。三、研究结果（一）ANRIL促进肺癌细胞辐射损伤的同源重组修复ANRIL在肺癌细胞中高表达,其半衰期约为6-8小时。ANRIL敲低使肺癌细胞电离辐射诱导的DNA损伤程度加重,HR修复效率降低60%左右,而对NHEJ修复效率无明显影响;ANRIL过表达使肺癌细胞电离辐射诱导的DNA损伤程度减轻。HR修复主要由ATR和ATM分子介导。进一步研究显示,ANRIL敲低抑制肺癌细胞电离辐射后ATR下游信号分子RPA2和CHK1的磷酸化,而对ATM下游信号分子KAP1和CHK2的磷酸化无明显影响;ANRIL过表达增强肺癌细胞电离辐射后ATR、RPA2、CHK1和P21的磷酸化,而对KAP1的磷酸化无明显影响;提示ANRIL通过ATR介导的HR修复促进肺癌细胞电离辐射诱导的DNA损伤修复。我们通过免疫荧光染色进一步验证了这一结果:ANRIL敲低使肺癌细胞电离辐射后ATR和RPA2 foci数量减少,而ANRIL过表达使肺癌细胞电离辐射后ATR和RPA2 foci数量增多。另外,我们通过RNA测序发现,ANRIL敲低显著影响肺癌细胞电离辐射后DNA损伤应答相关信号通路（PPAR信号通路、PI3K-Akt信号通路、p53信号通路）的基因表达。下一步我们通过肺癌荷瘤模型,在体内实验中验证ANRIL下调肺癌细胞辐射敏感性并促进HR修复。ANRIL敲低使肺癌荷瘤组织电离辐射后生长增殖抑制加重,原位凋亡增多,DNA损伤加重,HR修复关键分子ATR、RPA2、Rad51表达下调;ANRLI过表达使肺癌荷瘤组织电离辐射后生长增殖抑制减轻。（二）ANRIL通过直接结合ATR并抑制泛素化途径以维持其蛋白稳定性以上研究表明ANRIL通过促进ATR及其下游信号分子RPA2磷酸化激活而促进HR修复。为了明确ANRIL与ATR、RPA2的相互作用关系,我们通过RNA pull down检测发现ANRIL可与ATR结合,而不与RPA2结合;并通过RNA结合蛋白免疫沉淀进一步证实了ANRIL与ATR结合,且不受ATR磷酸化水平的影响。进一步研究显示,ANRIL可以结合ATR的N末端而不与ATR的C末端结合。另外,我们还发现ANRIL的5’-区域（1-880nt和881-1640nt）可以结合ATR,而其3’-区域（1641-2480nt和2481-3857nt）不与ATR结合。为了进一步研究ANRIL结合ATR后对其确切影响,我们通过蛋白质免疫印迹分析发现ANRIL敲低使肺癌细胞电离辐射后ATR总蛋白下降;进一步研究发现ANRIL敲低并不影响肺癌细胞电离辐射后ATR m RNA表达水平,表明ANRIL可能对ATR蛋白存在翻译后调控。我们进一步对ANRIL敲除肺癌细胞用蛋白酶体抑制剂（MG132）预处理后予以电离辐射,结果发现MG132预处理的ANRIL敲低肺癌细胞在电离辐射后的ATR蛋白下降得以恢复;我们还通过免疫共沉淀检测ATR特异性抗体免疫沉淀的蛋白质复合物中的泛素化水平,结果发现ANRIL敲低使肺癌细胞电离辐射后泛素化水平升高;表明ANRIL敲低使肺癌细胞电离辐射后ATR总蛋白下降是通过泛素化降解调控的,ANRIL结合ATR可以抑制其泛素化降解过程。最后,我们进一步验证了ANRIL与ATR相互作用可以降低肺癌细胞电离辐射敏感性。在ANRIL敲低肺癌细胞中过表达ATR可以提高肺癌细胞电离辐射后增殖能力,并减轻DNA损伤程度;在ANRIL过表达肺癌细胞中敲低ATR可以降低肺癌细胞电离辐射后增殖能力,并加重DNA损伤程度。四、结论本研究在细胞和动物水平明确了ANRIL可以通过促进肺癌细胞电离辐射后ATR及其下游信号分子的磷酸化激活而促进HR修复,减轻DNA损伤程度,进而降低肺癌细胞辐射敏感性。ANRIL可以直接结合ATR而发挥调控作用,二者的结合不受ATR磷酸化水平影响,且ANRIL只与ATR的N末端结合,而不与ATR的C末端结合。另外,ANRIL的5’-区域（1-880nt和881-1640nt）在ANRIL结合ATR中必不可少。ANRIL结合ATR有助于维持其蛋白稳定性,其机制是抑制ATR蛋白翻译后泛素化修饰。ANRIL通过与ATR相互作用可降低肺癌细胞辐射敏感性。我们的研究结果表明,ANRIL有望成为克服肺癌放疗抵抗的新靶点。