柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)是柑橘生产上最具毁灭性的病害之一,对全球柑橘产业造成巨大的经济损失。该病害普遍认为是由原核生物、薄壁菌门、α-变形菌纲(Proteobacteriacea)的韧皮部杆菌属(“Candidatus Liberibacter spp.”)所引起,但该病原尚不能进行人工培养,未能完成柯赫氏法则。早期的研究发现在感染黄龙病的柑橘植株内可以同时检测到韧皮部杆菌(“Candidatus Liberibacter asiaticus”,CLas)和植原体(“Candidatus phytoplasma asteri”,CPa),但关于二者的关系尚不清楚。目前,实时荧光定量PCR技术已广泛用于CLas的检测,而用于CPa的检测还未有报道,本研究基于CPa的16S rDNA核酸序列的特异序列区域,设计特异性检测CPa的引物。本研究利用难培养菌的指示植物长春花(Catharanthus roseus)为实验材料,通过比较感染CLas的长春花的不同组织的嫁接传病率来探索传病效率更高、传病速度更快的嫁接方式;采用分别含CLas和CPa的嫁接材料结合不同嫁接组合的方法比较两种病原在长春花上的嫁接传病速度,转移方向,病原菌增殖、分布的情况来探索它们之间的互作关系。叠氮溴化锭(Ethidium Monoazide Bromide,EMA)是一种特异性核酸染料,有选择性的进入死细胞内与其DNA紧密结合形成共价复合物,使得DNA不能进行PCR扩增。本研究利用EMA-PCR检测技术对染病长春花和柑橘的不同发病时期叶片的活菌含量进行测定分析,便于更准确的掌握染病植株叶片不同发病时期CLas的活菌含量。取得的主要研究结果如下:1、将柑橘黄龙病相关菌CPa的16S rDNA核酸序列与6个其他植原体以及植物叶绿体16S rDNA序列进行比对分析,基于CPa的16S rDNA特异序列区域,设计了特异检测CPa的实时荧光PCR引物CPa1-F/CPa1-R及探针CPa-P。2、独创了单叶嫁接法,并与传统的芽条嫁接法进行比较。试验结果表明单叶嫁接传染CLas的传病率为79.00%(79/100),而芽条嫁接的传病率49.17%(59/120),单叶嫁接不仅传病效率高,传病速度也快。此外,长春花植株中可用于嫁接的单叶片数量远高于可用于嫁接的芽条数量,进一步表明单叶嫁接法比芽条嫁接法更有优势。3、三种不同嫁接组合试验的结果表明:CPa单独侵染长春花时引起花变叶、节间缩短和叶片丛生等症状,但并不导致植株死亡;CLas单独侵染长春花时会产生叶片斑驳的症状,约2个月后造成长春花死亡;CLas和CPa同时侵染长春花时,同时出现斑驳和花变叶等症状,且CLas的浓度显著低于CLas单独侵染时CLas的浓度,约3个月后长春花死亡,说明了CPa的侵染对CLas的生长具有一定的抑制作用。此外,试验结果还表明CLas在长春花植株内的转移速率较CPa快,但增殖速率较CPa慢。4、在染病长春花组织切片中,透射电镜观察到大量的CLas和CPa病原,两种病原菌都呈圆形、短椭圆形和杆状形等多种形态,无细胞壁的CPa病原以圆形居多。CLas的大小约为90~420×320~1700 nm,具有三层膜结构,膜厚度约为20 nm。而CPa大小约为57~307×300~700 nm,同样具有三层膜结构,膜厚度约为9 nm,在大小和膜厚度上小于CLas。在复合侵染的样品切片中可看到两者同时存在同一筛管细胞内,但因CPa限制了CLas的增殖,CLas病原菌数量较少。5、EMA-PCR技术的检测结果显示,50μg/mL的EMA试剂对长春花叶片中CLas的死菌抑制效果最明显;感染前期的长春花叶片中CLas活菌含量显著高于其他时期(p<0.01),且症状最不明显;柑橘的中后期叶片中症状较明显,但CLas的活菌含量要高于前期叶片的CLas活菌含量。