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目的:为加深对莫尼茨绦虫表达基因信息的了解,建立了扩展莫尼茨绦虫基因表达谱芯片,达到研究莫尼茨绦虫成虫不同发育阶段基因表达改变的目的,从分子水平上探索与生长发育有关的基因。
方法:利用SMART技术,采用Clontech公司的SMARTTM cDNA Library Construction Kit构建扩展莫尼茨绦虫成虫全长cDNA文库。用Trizol Reagent提取总RNA和Oligotex mRNA Kits分离mRNA,以逆转录酶PowerScriptTM合成第一链cDNA,通过LD-PCR合成并扩增ds cDNA;扩增产物经蛋白酶K消化、SfiⅠ酶切、过SPIN-400TM柱去除小片段,连接到SfiⅠ消化过的pBluescriptⅡ SK*质粒载体中,最后将重组质粒转化到E.coliDH-5α内得到原始文库,扩增后将文库保存于96孔细胞培养板中。用文库得到的1080个EST制备了扩展莫尼茨绦虫cDNA芯片。该芯片一个域有52行、78列,密度为863点/c㎡,其中包含1080个靶基因,9个阳性对照,16个阴性对照,8个空白对照,每个基因做3个重复。用扩展莫尼茨绦虫的幼节、成节、孕节以及贝氏莫尼茨绦虫的幼节、成节、孕节与扩展莫尼茨绦虫头颈节总RNA与芯片进行杂交,获得不同发育阶段的差异表达基因,并选择其中有差异表达的部分基因进行实时荧光定量RT-PCR验证。
结果:构建的cDNA文库滴度为2.52×105 pfu/ml;重组率为94.7%,插入片段多在0.5kb~3 kb之间,测序结果显示EST平均长度586 bp。经5端测序获得2642条有效序列,归并为1080条Unigene。与GenBank库中的人、小鼠、线虫和斑马鱼蛋白库比对,找到361条保守基因,数目最多的是两类编码结构蛋白和酶的基因。向NCBI的GEO数据库提交了一个系列的杂交结果,系列号为GPL1164,共包含6张贝氏莫尼茨绦虫基因表达谱和6张扩展莫尼茨绦虫基因表达谱。通过差异基因筛选,共找到扩展莫尼茨绦虫幼节特异表达基因1条,成节特异表达基因50条,孕节特异表达基因42条;贝氏莫尼茨绦虫幼节特异表达基因8条,成节特异表达基因54条,孕节特异表达基因31条;两个虫种共有的成节特异表达基因23条,孕节特异表达基因5条,未找到幼节共有的特异表达基因;筛选出扩展莫尼茨绦虫表达但贝氏莫尼茨绦虫未表达或该基因在两虫种间同源性低的基因16条。
结论:成功构建了扩展莫尼茨绦虫成虫全长cDNA文库,获得了较丰富的扩展莫尼茨绦虫成虫表达基因,为筛选扩展莫尼茨绦虫的功能基因全长序列奠定了基础。后续的芯片杂交筛选出特异表达基因,这些基因经GO功能分类主要有:胞苷酸激酶、cAMP依赖的蛋白激酶、磷酸丙酮酸水合酶、金属离子结合、ATP结合等,大部分基因功能未知。成节特异高表达基因主要有钙调素、烯醇酶、β-微管蛋白、胞苷酸激酶和腺苷酸激酶、富含半胱氨酸蛋白前体等;孕节特异高表达基因主要有Ag5前体等;对这些基因的生物学功能结合当前数据库和文献报道,成节钙调素高表达而孕节则下调,可能说明钙调素在成节生殖功能最旺盛时有利于肌肉收缩,排出配子以便精卵结合以及其它相应功能所需;核苷酸激酶和DNA和RNA等核酸链的合成有关,成节在生殖最旺盛时其DNA复制必然速度很快,也是最需要的;可以通过寻找抑制烯醇酶表达的靶位点或者药物,来抑制绦虫的生长,进而控制其传播。