【摘 要】
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干扰素诱导跨膜蛋白（Interferon-inducible transmembrane proteins,IFITMs）作为一种宿主限制因子在天然免疫中发挥着重要的抗病毒作用。IFITMs可限制多种囊膜RNA病毒入侵宿主细胞,通过阻止病毒核酸释放至胞质中来抑制病毒复制的目的。冠状病毒属于正链RNA病毒,严重威胁公共卫生安全与养殖业发展。猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastro
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干扰素诱导跨膜蛋白（Interferon-inducible transmembrane proteins,IFITMs）作为一种宿主限制因子在天然免疫中发挥着重要的抗病毒作用。IFITMs可限制多种囊膜RNA病毒入侵宿主细胞,通过阻止病毒核酸释放至胞质中来抑制病毒复制的目的。冠状病毒属于正链RNA病毒,严重威胁公共卫生安全与养殖业发展。猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）属于冠状病毒中的一员,其感染可导致仔猪腹泻,给养猪业造成巨大的经济损失。目前尚无研究探索IFITM3是否对TGEV感染具有抗病毒作用及相关机制。因此,本研究旨在探索猪源IFITM3对TGEV的抗病毒机制。主要研究内容如下:1.TGEV感染激发PK15细胞的天然免疫反应。以相同MOI的TGEV感染PK15细胞,在不同时间端收获RNA,反转录后利用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测细胞中的与天然免疫相关的细胞因子mRNA转录水平。结果发现,TGEV感染可导致宿主细胞中IFNs、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、IFITM1、IFITM2、IFITM3及Mx1的mRNA水平均显著性上升。其后通过Western Blot检测TGEV感染引起内源性IFITM3蛋白表达水平变化,结果显示IFITM3的蛋白表达水平随感染时间增加而显著上升,这与Real-time PCR结果基本一致。2.成功构建稳定过表达猪源IFITM3或稳定干扰内源性IFITM3细胞系。通过慢病毒表达系统以及RNAi技术分别构建稳定过表达猪源IFITM3的PK15细胞系（PK15-IFITM3）以及稳定干扰内源性IFITM3表达的PK15细胞系（PK15-IFITM3KD）。分别应用间接免疫荧光试验（Indirect immunofluorescence assay,IFA）和Western Blot检测PK15-IFITM3细胞中IFITM3的定位和表达情况,结果发现过表达IFITM3蛋白分布于细胞质,且与对照组相比,其表达量有显著提高;而Real-time PCR结果也显示PK15-IFITM3KD细胞中IFITM3的mRNA表达水平下调近77%。进一步MTT试验结果显示PK15-IFITM3与PK15-IFITM3KD的细胞活性与正常PK15细胞无显著性差异。3.IFITM3对TGEV的抗病毒机制与影响抗病毒功能的重要氨基酸位点。以相同MOI的TGEV分别感染PK15-IFITM3与PK15-IFITM3KD细胞,并通过Real-time PCR检测细胞中TGEV的拷贝数以及炎性细胞因子的表达情况,结果显示,与正常细胞组相比,PK15-IFITM3细胞中TGEV的拷贝数显著下降,且炎性细胞因子mRNA转录水平亦显著性下降。与之相反,PK15-IFITM3KD细胞中病毒拷贝数显著提高,且进一步研究发现IFITM3主要是抑制TGEV对细胞的吸附。此外,通过将IFITM3 N端结构域中的18TYEMLK25分别定点突变为丙氨酸。发现Y20A与M22A的IFITM3突变体可促进TGEV复制,但K24A突变体却提高了IFITM3对TGEV的抑制作用。4.IFITM3与内体抑制剂协同发挥抑制TGEV感染的作用。以相同MOI的TGEV分别感染PK15-IFITM3或PK15-IFITM3KD细胞系,并用内体酸化抑制剂NH4Cl或氯喹磷酸盐（Chloroquine Phosphate,CQ）处理细胞,通过Real-time PCR检测TGEV的拷贝数与炎性细胞因子的mRNA表达量。结果发现,内体抑制剂能够促进IFITM3对TGEV感染的抗病毒效果。除此以外,细胞中的炎性细胞因子mRNA表达水平也显著性低于对照组。反之,内体抑制剂在一定程度上可以补偿IFITM3缺失引起的抗病毒效果丢失现象。
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