马蹄内翻足大鼠模型蛋白质组学分析及相关基因研究目的先天性马蹄内翻足(congenital talipes equinovarus，CTEV；congenital clubfoot，CCF)是一种儿童常见的严重影响足功能的先天畸形，发病率约为0.64～8‰，男女之比约为2.0～2.5:1，双侧同时发病占50％，右足多于左足。畸形主要包括前足内收内旋、后足内翻、踝关节下垂、胫骨内旋，该病虽不影响患儿生存和生育，但严重影响其生活质量。目前，马蹄内翻足的病因仍不清楚，以往对马蹄内翻足的病因、病理和发病机制的研究认为，该病与骨骼发育异常、神经肌肉病变、软组织挛缩、血管异常、遗传、宫内发育阻滞有关。很多学者对该病的病因提出了各种假说，如：宫内压力增加，骨组织、血管、连接组织、肌肉和神经组织发育异常等假说，但尚无定论。遗传流行病学研究表明，遗传因素是马蹄内翻足发病主要原因之一。蛋白质是细胞功能的执行者，蛋白质组决定细胞乃至组织和器官的表型。蛋白质组是整套基因组表达的一系列蛋白，蛋白质组学是在大规模地对蛋白质进行综合分析的基础上，通过对某物种、个体、器官、组织或细胞的全部蛋白质性质的研究，进而对蛋白质所执行的生理性、病理性生命活动做出精细、准确、本质的阐述。“表达蛋白质组学”是现今应用最为广泛的蛋白质组学研究模式，其技术路线是通过双向凝胶电泳建立蛋白质组图谱、用图像扫描分析软件进行图像分析、通过质谱及蛋白质数据信息处理技术进行蛋白质的鉴定与分析。由于患儿标本难以获取，并且存在加重足部损伤的风险，因此建立马蹄内翻足动物模型对其发病机制进行深入研究非常必要。我们在全反式维甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)诱导大鼠模型的基础上，采用双向电泳的方法对踝部骨骼、踝部组织和脊髓蛋白质组进行分离，通过软件分析和质谱—生物信息学方法寻找疾病相关蛋白质，进一步研究其在马蹄内翻足发生中的作用，以阐述其致病的遗传机制。细胞凋亡在胚胎多种器官形态、结构的形成中发挥重要作用。在胚胎发育过程中，细胞凋亡和有丝分裂的协调作用维持器官和组织中细胞数量的恒定。由于不同因素的作用导致细胞凋亡与有丝分裂的失衡均能导致先天性畸形，因而细胞凋亡又是致畸因素导致胚胎异常发育的重要形式。因此，在本研究中我们还探讨了细胞凋亡与脊髓、骨骼和肌肉组织发生的关系。我们的前期工作通过对马蹄内翻足动物模型胎鼠胫骨后肌组织的蛋白质组学的实验分析，发现X连锁凋亡蛋白抑制因子(X-Linked inhibitor of apoptosis protein，Xiap)在大鼠模型中表达下调10倍以上，因而本实验进一步分析该基因和蛋白在马蹄内翻足大鼠模型及患儿中的表达情况，同时选择该基因区域内3个已知单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism，SNP)位点，检测其在84个CTEV家系中的分布情况。探讨其与单纯性CTEV的相关性，为寻找CTEV易感基因奠定基础。方法将孕10d Wister大鼠随机分为对照组和实验组，按135 mg/kg体重灌胃法给予实验组大鼠ATRA，对照组给予相应体积矿物油。孕21d剖腹取出胚胎，分离脊髓、踝部骨骼(下肢踝关节上2mm至足正中，去除肌肉、皮肤组织)及踝部组织(下肢踝关节上2ram至足正中，去除骨骼)。提取胎鼠踝部骨骼、踝部组织及脊髓的总蛋白质，Bradford法进行蛋白定量。等电聚焦使用PROTEAN IEF等电聚焦仪。聚焦后的胶条经两步平衡后进行SDS—PAGE电泳，染色、扫描后用PDQuest 7.1.0进行图像分析。切取差异点并进行质谱和生物信息学分析。取ATRA处理孕鼠和对照组孕鼠各5只，每只孕鼠取一只胎鼠，中性甲醛固定，脊柱和后足平面石蜡切片。应用DeadEndTM Fluometric TUNEL System，按照其说明书检测马蹄内翻足模型胎鼠和对照组胎鼠凋亡细胞发生率的变化。用TRIzol试剂分别提取模型大鼠和对照胎鼠的脊髓、踝部骨骼和胫骨后肌群组织及CTEV患儿和正常儿童拇长屈肌的总RNA。用RT-PCR方法检测xiap和col2a1基因在三种组织中的表达情况，检测XIAP基因在拇长屈肌中的表达情况，进一步分析与马蹄内翻足畸形的相关性；通过Western Blot检测大鼠模型肌肉组织中Xiap蛋白表达；应用免疫组化分析大鼠模型脊髓、踝部骨骼和肌肉组织中Xiap蛋白表达及XIAP蛋白在患儿拇长屈肌中的表达。提取84个CTEV核心家系外周血DNA，以其为模板，PCR扩增SNP位点rs17334732、rs1733630及rs17334725基因序列；用限制性内切酶对各SNP位点进行基因分型，统计分析各SNP位点与单纯性CTEV的相关性。结果孕21d剖检共获取胎鼠344只，其中对照组112只，实验组232只。对照组CTEV畸形发生率为零；实验组CTEV畸形发生率为80.98％，其中单纯CTEV发生率达29.27％。使用宽pH(pH3-10)胶条和窄pH(pH5-8)胶条所获图谱均显示多数蛋白质点匹配良好。通过PDQuest7.1.0软件分析发现许多蛋白点存在表达差异，最后选得界限清楚差异点22个，经质谱检测肽质量指纹谱质谱分析和Mascot蛋白质数据库(http://www.matrixscience.com)搜索，发现Ⅱ型胶原蛋白等18种蛋白表达发生改变。细胞凋亡检测可见，马蹄内翻足畸形鼠细胞凋亡的发生率明显高于对照组。畸形鼠脊髓、骨骼和肌肉细胞凋亡发生率是对照组的5.4、10和3.7倍。畸形鼠脊髓、骨骼和肌肉细胞凋亡发生率与对照组相比，差异具统计学意义(P＜0.01，χ~2检验)。半定量RT-PCR分析结果表明，col2a1在畸形鼠踝部骨骼表达下调；xiap在骨骼、肌肉和脊髓3个组织中表达均下调，其中肌肉下调最为明显。XIAP基因在患儿拇长屈肌中的表达下调。免疫组化染色分析结果发现畸形鼠Xiap在脊髓、肌肉和骨骼表达均下调，其中骨骼下调最为明显；XIAP蛋白在患儿拇长屈肌中的表达降低。Western Blot分析发现，马蹄内翻足大鼠模型胫骨后肌群组织比正常对照胎鼠胫骨后肌群组织Xiap蛋白表达降低。PCR扩增目的片段的长度与预期相符；rs17330630位点未检测到多态，rs17334732和rs17334725 SNP位点存在多态。统计分析结果表明：rs17334725差异无统计学意义(X~2=4.7872，P＞0.05)；rs17334732差异有统计学意义(X~2=11.7556，P＜0.05)。结论1．应用双向电泳技术获得了重复性好的孕21d模型胎鼠和对照胎鼠踝部骨骼、踝部组织及脊髓组织双向电泳图谱。2．马蹄内翻足大鼠模型与正常对照胎鼠踝部骨骼、组织和脊髓蛋白质组存在差异，发现Ⅱ型胶原蛋白等18种蛋白点表达改变。Col2a1基因表达下调可能与先天性马蹄内翻足发生相关。3．发现马蹄内翻足大鼠模型脊髓、肌肉和骨骼凋亡发生率高于正常胎鼠，证明细胞凋亡相关调控基因表达异常在先天性马蹄内翻足的发生、发展过程中发挥重要作用。4．在蛋白质组分析基础上，进一步发现在X连锁凋亡蛋白抑制因子基因及蛋白在马蹄内翻足大鼠模型和马蹄内翻足患儿表达下调，应用SNP关联分析进一步证实该基因与CTEV相关。