Era同源分子在生物界分布广泛，从原核生物细菌到真核生物、小鼠、人，Era 形成一新的G 蛋白亚家族，在生物体内发挥着重要的作用。在原核生物中，Era 参与细胞周期调控和核糖体rRNA 的加工与成熟，是细菌生长必需的GTPase 分子，era 基因突变引起的Era 分子的GTPase 活性缺失或合成减少将导致细胞分裂期阻滞和核糖体rRNA 成熟障碍；在哺乳动物，Era 在多种正常组织中表达，Era 突变或Era 的表达减少可引起细胞周期阻滞。但目前Era 确切的功能机制仍然不清。因此，进一步研究Era 的功能对于我们系统地认识生物的生存机理和Era 这一新的G 蛋白亚家族在细胞中的生理作用都具有重要的理论意义。 为了进一步研究Era 的功能，本课题组陈南春高级实验师用地高辛(DIG)标记的Era 蛋白从大肠杆菌基因组噬菌体表达文库中筛选了Era 相互作用分子。本研究在此基础上，我们对筛选到的YggG 分子与Era 蛋白间的物理和功能相互作用、yggG 基因的表达特征、表达调控、以及YggG 在大肠杆菌中的作用进行了深入的研究。同时在哺乳动物水平，检测了人era 在多种肿瘤组织中的表达特征，以及在腺上皮和鳞状上皮的表达特征，并分析了人Era 的表达与腺癌鳞癌的关系，从中我们探讨了Era 分子在细胞内可能的功能机制。 主要研究结果包括： 1. YggG 是一Era 结合蛋白。 在利用地高辛标记的Era 从大肠杆菌基因组表达文库中筛选Era 结合分子实验中，我们发现yggG 基因表达产物与Era 存在相互作用。在此研究中通过GST pull-down 和免疫共沉淀实验进一步在体外和体内证实了Era与YggG 蛋白间的相互作用。并且在实验中我们发现Era-1 突变体蛋白同样与YggG 蛋白间存在结合作用，此结果提示Era 蛋白的GTPase 酶活性不影响Era 与YggG 蛋白间的物理性相互作用。 2. yggG 基因的表达特征及表达调控。 yggG基因编码一25 kDa预测的锌离子结合的金属蛋白酶，氨基酸序列分析显示YggG与其它一些热休克蛋白有较高的同源性。但至今未见关于yggG基因的任何研究报道。在本研究中，我们利用5-RACE (5-rapid amplify-cation of cDNA ends) 确定了yggG mRNA的5-末端，即转录起始位点(+1)，序列分析发现，yggG转录起始位点上游的DNA序列与大肠杆菌保守的启动子序列存在同源性，即-35 (TTCACC versus TTCAGA)，-10 (TAGAAT versusTATAAT)，一个可能的核糖体结合序列(AAGAG)位于目前GenBank 所预测的YggG蛋白翻译起始位点前。 为了分析转录调控，我们首先构建了原核分子报道载体系统，并对该系统进行了鉴定，将所预测的yggG 启动子区域不同的截短片段与lacZ 报告基因融合，不同截短体报道基因载体转化菌分别在应激条件和非应激条件下培养，通过β-半乳糖苷酶的活性检测确定截短片段的启动子活性和转录活性。结果显示，包含有yggG 基因转录起始位点前39bp 的DNA 片段具有启动子活性，而转录起始位点上游-339/-40 的DNA 片段不具有启动子活性。此结果说明，yggG 基因的启动子区位于-39/-1。进一步的研究发现，在热应激条件下，包含有yggG 基因转录起始位点前-105/-1 的DNA 片段的转录活性明显增加，而包含有yggG 基因转录起始位点前-39/-1 的DNA片段的转录活性没有明显变化。此结果提示，yggG 基因转录起始位点前的-105/-40 与应激诱导的转录调控相关。 为了证实DNA 片段-39/780 是表达25-kDa YggG 蛋白所必需的，我们将-39/780 (ORF3)和-339/780(ORF1)片段分别克隆入克隆载体，再将克隆载体转化大肠杆菌。结果显示，在含有ORF1 或ORF3 克隆载体的细菌中，YggG 蛋白的表达量明显高于仅含染色体基因拷贝的细菌中的表达量，此结果进一步证实了yggG 启动子的分析结果。-105/780(ORF2)为GenBank以前预测的YggG 的编码序列，而在细菌中过表达ORF2，抗YggG 免疫杂交可检测到两条带，一条为过表达的ORF2 编码的蛋白，另一条与在细菌中检测到的YggG 蛋白的分子量相同。此结果证实GenBank 以前预测的YggG 蛋白与细菌中天然的YggG 蛋白不同，ORF2 序列包含了yggG 基因的调控序列和编码序列。 另外，我们通过细胞免疫组化和细胞成份分析检测了YggG 在细菌中的定位，结果显示YggG 是一膜结合蛋白。 在此部分研究中，我们鉴定了yggG 基因的转录起始位点，启动子区域，应激相关的转录调控区域。我们的结果提示yggG 基因编码一25kDa的膜结合蛋白。我们的研究同时证明，在细菌内yggG 基因不能编码以前GenBank 预测的YggG(294aa)分子，yggG 基因所编码的蛋白分子可能为YggG (252aa)、YggG (243aa)或YggG (231aa)。由于过表达YggG (252aa)对细菌的生长具有抑制作用，为了避免这种人为的结果对YggG 蛋白功能研究的影响，在对YggG 功能研究的过程中我们采用了对细菌生长无明显影响的YggG(231aa)，即氨基端截去21aa 的YggG 作为研究工具。 3 Era-1 突变体蛋白通过上调yggG 基因的表达抑制Era-1 引起的细菌生长抑制，从而促进含有Era-1 突变体蛋白的细菌生长。 转录活性实验显示，yggG-lacZ 融合在era-1 突变株(BSP750)的表达并没有因为此菌株生长率的严重减缓而随之减少，而是与其在野生型菌株一样保持了相同的表达水平。但是在Era 表达减少的HT120 菌株，yggG-lacZ融合的表达水平仅为野生型菌株的13％。RT-PCR 和Real-Time PCR 分析显示，yggG mRNA 在BSP750 细胞和过表达Era-1 突变体蛋白的细胞中显著增加。此结果提示，在细菌中Era-1 突变体蛋白的存在引起细菌的应激进而可以直接地或间接地刺激yggG 基因的表达。 为了研究YggG 在细菌中的作用，通过靶向重组系统构建了一yggG 基因敲除菌株ΔyggG，此菌株与野生型菌株在正常和高温条件下生长率相同，无明显表型变化。Era-1 的存在干扰30S 的装配从而抑制细菌的生长。 为了检测YggG 是否与之相关，我们比较了过表达Era-1 的野生型菌株和过表达Era-1 的ΔyggG 菌株的生长率，结果显示过表达Era-1 在ΔyggG 菌株表现更强的生长抑制效应。 进一步我们分析了过表达YggG 对era-1 菌株生长的影响，结果显示过表达YggG 对era-1 菌株生长无影响。也许因为在era-1 菌株中已诱导了足量的YggG 发挥其功能。只要有正常的Era 存在，YggG 也许可以抑制Era-1突变体蛋白对30S 装配的干扰，从而改善细菌的生长状况。为了证明此假设，我们比较了过表达Era-1 的菌株和同时过表达Era-1/YggG 的菌株的生长率，结果显示，同时过表达YggG 可以减轻过表达Era-1 对细菌的生长抑制效应。结果提示，YggG 会随着Era 的GTPase 酶活性降低而表达升高，YggG 可能参与Era 在细胞内作用的生理过程，另外，此结果说明Era 突变干扰30S 的装配引起某种翻译应激，此应激诱导一些应激因子表达，YggG 作为热休克蛋白参与细菌的这些应激反应。 4. 分析人Era 的表达特征及作用 我们通过免此疫组化检测了人Era 在个体中的表达差异。通过原位杂交我们检测了hera 在不同肿瘤组织中的表达状况，结果显示hera 在消化道肿瘤和腺上皮肿瘤中的表达相对较高。我们通过免疫组化检测了40 例结肠腺癌患者和40 例食道癌患者肿瘤组织及相应瘤旁正常组织中hEra 蛋白的表达水平，经统计分析，hEra 在正常腺上皮的表达显著地高于其在鳞状上皮中的表达(P<0.01)；hEra 在正常腺上皮组织中的表达明显高于其在腺癌组织中的表达(P<0.01)，并且分化程度越低的腺癌，hEra 蛋白的表达越低，甚至接近于不表达；但是hEra 在鳞状细胞癌组织与正常的鳞状上皮组织中的表达无显著差异。提示hEra 可能与腺上皮来源的肿瘤的发展相关。 综合我们的研究结果，我们认为YggG 与Era 在功能上相关，YggG 作为热休克蛋白，对细菌中Era 蛋白突变所引起的应激做出反应，从而在应激条件下发挥着维持细胞稳态的功能。而人Era 可能参与肿瘤的发展过程。