表达pri-mir-302/367基因的慢病毒颗粒的制备及其感染人脐血单个核细胞的实验究

来源 :宁夏医科大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:tongruanclassone
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目的制备可诱导表达pri-mir-302/367基因的重组慢病毒颗粒,并在HeLa细胞中研究该基因对多能性基因的调控作用;通过病毒感染人脐血单个核细胞(human cordblood mononuclear cells,hCBMNC),旨在探究该基因对hCBMNC的重编程作用。方法(1)以正常人基因组DNA为模板,PCR扩增目的基因,将目的基因连接入酶切线性化的pLV-TRE质粒,构建pLV-TRE-302慢病毒重组体,酶切及测序予以鉴定。(2)通过重组质粒和辅助质粒共转染293T细胞对慢病毒进行包装及滴度测定;用病毒转染HeLa细胞,强力霉素(doxycline, DOX)诱导后,通过real time-PCR测定miR-302/367家族基因及其下游调节基因Oct4、Sox2和Nanog的表达情况。(3)用病毒感染hCBMNC,经DOX诱导后,在胚胎干细胞培养基培养条件下观察其形态学变化,并用real time-PCR分别检测多能性基因Oct4、Nanog、Sox2、Klf4和c-Myc的表达情况。结果(1)成功制备pri-mir-302/367重组慢病毒颗粒,基因测序结果与目标序列完全一致,病毒滴度为5×106TU/mL。(2)DOX诱导72h后,real time-PCR结果显示HeLa细胞中miR-302/367家族基因及受其调节的多能性基因均得到不同程度的上调。(3)经重组慢病毒感染的hCBMNC未见克隆形成,但real time-PCR结果显示其多能性基因Oct4、Sox2和Nanog均得到上调。结论本研究成功制备表达pri-mir-302/367的重组慢病毒颗粒,并在HeLa细胞中初步验证该基因对多能性基因的调控作用;通过观察和检测受病毒感染的hCBMNC形态学及相关基因的变化,初步探讨了诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)研究的关键技术,为后续的重编程研究奠定了实验基础。
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