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口蹄疫(Foot and mouth disease,FMD)是偶蹄动物的一种急性、发热性、高度接触性传染病,其临床诊断特征是在口腔粘膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱和溃烂,食用者感到恐惧恐慌从而导致经济和社会效益显著损失。以植物反应器生产口蹄疫病毒疫苗已成为安全、稳定、低成本预防和控制该疾病的研究重点和热点。申慧峰(2005)以马铃薯块茎特异性表达启动子patatin构建口蹄疫病毒表面抗原融合蛋白编码基因CTB-VPl的植物双元表达载体pBICVP,以农杆菌介导转化马铃薯,获得PCR检测的转基因植株。本论文以Western blotting证实其为转CTB-VP1基因阳性表达植株;在此基础上建立快速繁育和微型薯诱导培育技术体系;并进行转基因马铃薯块茎表达融合蛋白CTB-VPl的分离、纯化和检测,为马铃薯作为生物反应器生产、制备口蹄疫病毒表面抗原CTB-VP1疫苗提供理论和技术基础。主要研究成果如下:1.以Western blotting结果证实,CTB-VP1融合基因在马铃薯块茎中,表达融合蛋白相对分子量约52 000 Da。2.建立了转基因马铃薯离体快繁与微型薯诱导培养技术体系,最佳增殖培养基是MS培养基;马铃薯带腋芽茎段先光照壮苗培养10d,后加入液体诱薯培养基暗培养,20 d后诱导出微型薯;春季适宜炼苗与移栽,移栽苗在30 d后成活率达83%,90 d后收获的微型薯均重3g/粒;添加300 mg/L矮壮素(CCC)的MS培养基适于组培苗的保存,保存时间达120 d。3.确定了转基因马铃薯块茎适宜的破碎和总蛋白提取方法,即,块茎于-80℃冷冻过夜,钝物敲碎,冰浴研钵研磨,匀浆加入缓冲液,在超声波破碎仪上破碎30min;最适缓冲液是0.1 M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠;适宜的提取缓冲液pH值为7.4;提取时材料与缓冲液比为1:3(w/v);以SDS-PAGE和Western blotting检测,确定了分级沉淀目的蛋白的硫酸铵浓度范围为30～70%。4.获得了本实验室条件下CM Sephadex C-50弱酸性阳离子交换层析纯化目的蛋白的最佳条件:层析平衡液为pH 6.0的0.02M磷酸缓冲液;最适上样量为50 mL;梯度洗脱溶液的NaCl浓度为0.05-0.30 mol/L,pH为6.5;流速控制在0.5 mL/min。离子交换层析收集稀蛋白溶液采用冷冻干燥法浓缩,其蛋白质回收率显著高于其它方法。回收的蛋白经15%SDS-PAGE和Western blotting检测后,用Sephadex G-100葡聚糖凝胶过滤层析进一步纯化,产物经Western blotting分析表明,纯化的蛋白与口蹄疫病毒(FMDV)抗血清在52 KD处出现特异识别的信号带,表明纯化产物是目的蛋白CTB-VP1。5.纯化的马铃薯块茎表达口蹄疫病毒表面抗原融合蛋白CTB-VP1通过动物免疫试验并经过口蹄疫正向间接血凝试验检测,表明有特异性抗体产生,抗体阳性水平达1:64。