癌症/肿瘤是威胁人类身体健康的重大疾病。肿瘤成像或治疗通过将造影剂或药物靶向转运至肿瘤组织中,实现肿瘤成像或是消除肿瘤细胞的目的。细胞穿膜肽（CPPs）具有无细胞毒性、跨膜转运效率高、可修饰等特点,在基因编辑、再生医学、肿瘤成像与治疗、细胞调控、药物输送、纳米器件输送等领域被广泛应用。基质金属蛋白酶2/9（MMP-2/9）在肿瘤组织中高表达。将CPPs与CPPs抑制肽段用可被MMP-2/9选择性识别、水解的序列连接,形成可被MMP-2/9激活的可激活细胞穿膜肽（ACPPs）,实现对肿瘤组织的靶向给药。分子动力学模拟（MD）可用于获得分子的结构信息和动力学特征,以及探索分子间的相互作用机制,是研究蛋白质的构效关系、蛋白质与底物选择性识别以及瞬态动力学过程的有效手段。伞形取样通过增强对体系的采样,实现对自由能较为准确的计算。因此本文将综合运用MD和伞形取样方法来研究ACPPs的构效关系、MMP-2对底物肽选择性识别机制和CPPs跨膜转运过程。在本论文中,首先运用I-TASSER方法及MD预测ACPPs的最大概率结构,并通过圆二色谱实验进行验证。随后对比了 ACPPs及CPPs的跨膜动力学过程,并评估了 CPPs抑制肽段对CPPs跨膜效率的影响。随后运用分子对接和MD分析MMP-2对底物肽的结合机制,以及关键位点突变和伞形取样方法揭示MMP-2对底物肽的选择性。重点考察了 MMP-2在P1和P1,位点的化学环境,为理解MMPs的构效关系奠定了坚实的基础。最后本论文工作系统地研究了富含精氨酸的CPPs（ARCPPs）在跨膜传递过程中所涉及的各类因素:被携带到水孔中的水分子数量、胍鐺离子-PO4盐桥、磷脂分子的碳氢链长度以及有序度,对ARCPPs跨膜过程的影响。这部分工作对发展基于CPPs的下一代胞内递送策略具有重要的理论意义。定量地研究了相互作用能变化量与相应的自由能变化量之间的关系,以及跨膜自由能垒与所形成的水孔长度之间的关系。这部分工作对评估基于CPPs的胞内递送工具的跨膜效率奠定了理论基础。本论文的主要研究结论如下:1.圆二色谱结果表明,ACPPs二级结构中α螺旋占比约为63%,无规卷曲占比32%。在ACPPs最大概率结构中,CPPs抑制肽段与CPPs形成多个稳定的盐桥结构,这有效地屏蔽了参与盐桥形成的胍鐺离子的正电性。2.ACPPs在磷脂双层表面的吸附及跨膜过程中,CPPs抑制肽段始终保持对CPPs的静电屏蔽,导致CPPs与磷脂双层的PO4、羧基形成盐桥能力大幅下降,跨膜自由能垒提高66 kJ/mol。3.MMP-2的βⅣ链与底物肽所形成的氢键网络,对其与催化凹槽的稳定结合至关重要。当氢键网络被破坏,底物肽与MMP-2的结合自由能减少76kJ/mol。4.在P1位点,底物肽残基侧链暴露在溶液环境中,使得芳香性或长烷基侧链的残基在P1位点被抑制。在P1’位点,S1’疏水孔化学环境由Val112,His115和Tyr137 决定,空间大小被 Val112,His115,Pro135,Ile136 和 Tyr137 共同限制。在P1’位点残基侧链与S1,疏水孔几何性质的局部不匹配会显著地降低MMP-2与底物肽的结合自由能。5.在（Arg）9跨膜转运过程中,胍鎓离子与PO4间形成的多重盐桥是（Arg）9跨膜转运过程的驱动力,其占（Arg）9与磷脂双层整体相互作用能的65%。胍鎓离子与PO4形成的氢键数量为1.78±0.3,而铵基与PO4形成的氢键数量为0.34±0.1。因此铵基与PO4之间的主要相互作用形式是离子对。6.（Arg）9从溶液吸附到磷脂双层表面的吸附自由能（△GA）,与相互作用能（静电项+范德华项）的变化量（△EA）呈线性关系:△GA=0.0426*△EA+36.7,R2=0.92。（Arg）9进入到磷脂双层中并伴随着水孔形成的跨膜自由能垒（△GB）与相应的相互作用能变化量（△EB）呈正相关关系:△GB=0.108*△EB+135,R2=0.73。跨膜自由能垒△GB与水孔的有效长度（L）线性相关:△GB=46.2*L-31.3,R2=0.92。水孔的有效长度（L）与磷脂双层的疏水厚度（2DC）有良好的线性关系:L=1.02*[2Dc]-0.525,R2=0.995。磷脂分子的碳氢链长度和有序度会影响磷脂双层疏水厚度（2DC）,进而影响（Arg）9的跨膜自由能垒。综上所述,本项工作阐述了 ACPPs的结构-功能关系、为提高ACPPs肿瘤组织靶向性提供理论指引,并为基于CPPs的下一代胞内递送载体给出优化建议,以及为评估CPPs胞内递送效率提供定量关系。