背景:支气管哮喘(简称哮喘)是气道慢性炎症性疾病,伴随炎细胞的浸润,气道结构也发生改变,包括上皮纤维化,成纤维母细胞的沉积,气道平滑肌细胞的肥大和增生和杯状细胞的过分泌,这些变化导致了气道壁的增厚。气道重塑与气道炎症被认为是非依赖性的相平行的机制。氧化应激在气道炎症和气道重塑的发病机制中占重要地位。基质金属蛋白酶9(MMP-9)由各种炎症细胞产生,可分解细胞外基质损坏气道壁基底膜尤其是胶原主要成分胶原Ⅳ,它在炎症状态下被大量分泌。组织特异性基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)是MMP-9的内源性抑制剂,可与其前体结合特异性地抑制MMP-9的活性。褪黑素具有免疫调节、抗炎、抗氧化等多种作用。有研究表明褪黑素可能参与了哮喘的发病机制。目的:1.观察气道炎症和气道重塑在小鼠慢性哮喘模型中的变化;2.早期褪黑素和地塞米松干预对气道炎症和气道重塑发生、发展的影响;3. MMP-9、TIMP-1mRNA和蛋白在小鼠哮喘模型气道和肺组织中的表达;4.褪黑素、地塞米松及Luzindole对MMP-9、TIMP-1mRNA和蛋白的动态调节效应。5.研究褪黑素和地塞米松气道炎症和气道重塑发生、发展的影响的机制。6.探讨褪黑素、地塞米松及Luzindole对MMP-9、TIMP-1动态调节的机制,观察它们对MMP-9、TIMP-1的调节开始于转录水平还是转录后水平。方法:106只SPF级小鼠,饲养于屏障系统中,经适应性饲养1周后按随机数字表法分组。对照组于第0、7天对照组腹腔注射生理盐水0.4 ml,其他组于第0、7天腹腔注射卵蛋白悬液0.4 m(lOVA 100μg、硫酸铝钾20 mg溶于生理盐水1 ml),第14天起所有小鼠雾化吸入生理盐水30 min,隔天1次,每周3次;每次雾化前30 min腹腔注射分别注射生理盐水0.2 ml(对照组、哮喘组),其他组分别为褪黑素10 mg/kg,地塞米松1.5 mg/kg, Luzindole 30 mg/kg,各药物剂量均为文献证明的有效的剂量。前4组在雾化的第2、4、8周于末次雾化后24 h后处死小鼠取材。褪黑素拮抗组只做2周急性期组,致敏和腹腔注射Luzindole时间均选择在当日凌晨零点,避光操作,于末次雾化后24 h处死小鼠。取右肺下叶,4%多聚甲醛固定24 h,石蜡包埋,切片,片厚4μm。左肺和右肺上叶放置-70℃冰箱保存。用Masson三原色方法染色胶原纤维,用免疫组化方法标记蛋白,用MetaMorph软件测量单位长度基底膜周径上的胶原面积(Wcol/Pbm)和单位面积上基质金属蛋白酶9(MMP-9)及金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP-1)免疫组化阳性面积(PA/UA)。用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定肺组织相应蛋白mRNA水平。数据用x±s表示,采用SPSS 11.5统计软件对实验数据进行单因素方差分析,两样本均数的多重比较采用LSD-t检验进行两两比较,P<0.05表示有统计学意义。结果:整个实验过程中共死亡小鼠10只(其中4只因操作不当,其他死因不明),未见明显药物致死现象。最后完成观察的小鼠共96只。1、各组气道炎性细胞计数和气道形态学指标测定单位气道面积内,对照、哮喘、褪黑素及地塞米松4组中,哮喘组炎性细胞计数最高(P<0.01),对照组炎性细胞计数最低(P<0.01),褪黑素组和地塞米松组间没有明显统计学差异(P>0.05);褪黑素拮抗2周组明显高于哮喘2周组(P<0.01);各组雾化吸入2、4及8周后炎性细胞计数无明显差异(P>0.05)。哮喘组WAmuc/Pbm、WAm/Pbm、WAi/Pbm较对照组、褪黑素组和地塞米松组明显增加(P<0.01),褪黑素组、地塞米松组亦高于对照组(P<0.05),褪黑素组、地塞米松组间无显著差异(P>0.05),褪黑素拮抗2周组和哮喘2周组无显著差异(P>0.05)。各组2、4及8周间WAmuc/Pbm、WAm/Pbm、WAi/Pbm差异无显著性(P>0.05)。2、胶原沉积面积测定和杯状细胞积分测定哮喘组、褪黑素组、地塞米松组Wcol/Pbm大于对照组(P<0.01),哮喘组又大于褪黑素组和地塞米松组(P<0.01),褪黑素组、地塞米松组间无明显差异(P>0.05),褪黑素拮抗2周组和哮喘2周组亦无明显差异(P>0.05)。哮喘组在雾化吸入2、4及8周后胶原面积无明显差异(P>0.05)。对照组杯状细胞积分为0分,哮喘组杯状细胞积分明显高于褪黑素组、地塞米松组(P<0.01),褪黑素拮抗2周组明显高于哮喘2周组(P<0.01),褪黑素组和地塞米松组间无明显差异(P>0.05)。在褪黑素组、地塞米松组,雾化吸入4、8周后杯状细胞积分低于雾化吸入2周后(P<0.05)。3、单位长度基底膜上BrdU染色阳性细胞数哮喘组、褪黑素组、地塞米松组气管基底膜上(/um)BrdU阳性细胞数目明显高于对照组(P<0.01),哮喘组高于褪黑素组、地塞米松组(P<0.01),褪黑素拮抗2周组明显高于哮喘2周组(P<0.01),褪黑素组和地塞米松组间没有明显差异(P>0.05)。在对照组,雾化吸入8周后BrdU阳性细胞数目大于雾化吸入2周后。在哮喘组、褪黑素组和地塞米松组,雾化吸入4周、8周后BrdU阳性细胞数目大于雾化吸入2周后(P<0.05)。4、各组间MMP-9和TIMP-1 PA/UA比较哮喘2、4、8周组MMP-9的PA/UA分别与对照组2、4、8周组比较差异有统计学意义P均<0.01)。褪黑素组2、4、8周组MMP-9的PA/UA分别与哮喘组2、4、8周组比较差异有统计学意义(P均<0.01),地塞米松组4、8周MMP-9的PA/UA与哮喘组4、8周组比较差异有统计学意义(P均<0.01)。褪黑素拮抗2周组与哮喘2周组比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组在2周时比较差异无统计学意义(P均<0.01)。哮喘4周组TIMP-1的PA/UA与对照4周组比较差异有统计学意义(P<0.01),褪黑素4周组PA/UA与哮喘4周组比较差异有统计学意义(P<0.01),而地塞米松4周组与哮喘4周组比较差异无统计学意义(P>0.05);哮喘组8周组TIMP-1的PA/UA与对照8周组比较差异也有统计学意义(P<0.05),褪黑素8周组和地塞米松8周组PA/UA分别与哮喘8周组比较差异有统计学意义(P<0.01)。褪黑素拮抗2周组TIMP-1的PA/UA分别与对照2周组和哮喘2周组比较差异未达到统计学意义(P均>0.05)。5、MMP-9、TIMP-1、胶原Ⅲ、胶原Ⅳ的mRNA水平的变化哮喘2、4、8周组的MMP-9/β-actin分别与对照2、4、8周组比较差异有统计学(P均<0.01)。褪黑素2、4、8周组分别与哮喘2、4、8周组比较差异有统计学意义(P均<0.01),与对照2、4、8周组比较差异无统计学意义(P均>0.05),而地塞米松2、4周组分别与哮喘2、4周组比较差异有统计学意义(P均<0.01)。褪黑素拮抗2周组MMP-9/β-actin与对照2周组比较差异有统计学意义(P<0.01),与哮喘2周组比较差异无统计学意义(P>0.05)。以上各8周组间TIMP-1/β-actin比较差异无统计学意义(P>0.05)。哮喘2、4周组分别与对照2、4周组比较差异有统计学意义(P均<0.01);褪黑素4周组与哮喘4周组比较差异有统计学意义(P<0.05)。哮喘2、4、8周组胶原Ⅲ/β-actin水平与对照2、4、8周组比较差异有统计学意义(P分别<0.01、<0.01、<0.05)。褪黑素2、4、8周分别为胶原Ⅲ/β-actin分别与哮喘2、4、8周分别为比较差异也有统计学意义(P分别<0.05、<0.01、<0.05)。而地塞米松2、4周分别为胶原Ⅲ/β-actin分别与哮喘2、4周比较差异有统计学意义(P均<0.01)。哮喘2、4、8周组胶原Ⅳ/β-actin与对照2、4、8周组比较差异有统计学意义(P分别<0.01、0.05、0.01)。褪黑素2、4、8周组与哮喘2、4、8周组比较差异有统计学意义(P分别<0.05、0.05、0.01)。地塞米松2、4、8周组与哮喘2、4、8周组比较差异有统计学意义(P分别<0.05、0.05、0.01)。结论1、哮喘致敏和反复雾化激发小鼠所引起的气道病理改变可反映出哮喘患者的气道炎症和气道重塑;气道炎症和气道重塑在哮喘发病的早期即可出现,在一定时期内,并未随着哮喘病程的延长而程度加重。2、糖皮质激素作为哮喘治疗的一线药物可以抑制气道炎症,但是不能逆转气道重塑已经形成的结构改变。3、我们的研究结果发现褪黑素能抑制胶原的沉积,作用与地塞米松相当。4、哮喘刺激2、4、8周可以导致MMP-9的高表达。在我们的研究中TIMP-1在2周时并没有因为哮喘的刺激而显著升高,而只在4周时升高,这种反应的延迟性可能使得MMP-9分泌过量而活性无法被抑制,从而导致MMP-9/ TIMP-1失衡,这可能在气道重塑的发生机制中起到了重要的作用。5、褪黑素抑制胶原的沉积的作用很可能是通过抑制MMP-9的表达来实现的。褪黑素对MMP-9 mRNA和蛋白水平均有抑制,表明褪黑素对MMP- 9的抑制可能发生在转录水平。我们的研究还发现褪黑素对于TIMP-1 mRNA水平上的调节作用不是很显著,我们推测它对TIMP-1的调节更可能发生在转录后水平。