作为微生物发酵茶之一,茯砖茶是湖南黑茶中边销茶的主导品种,是我国西北边疆少数民族生活必需的日常饮料和常用民间医药。在茯砖茶的生产加工利用过程中仍存在一些生产商和消费者所关注的问题：(1)建立在传统自然发酵基础上的茯砖茶加工过程中微生物种类多而杂,产品品质不稳定,发酵周期长而使发花房周转慢；(2)目前虽然建立了现代化洁净的茯砖茶加工生产线和发花房,但没有适用的发酵剂及实用的发酵剂施用技术,它成为该装备的技术瓶颈；(3)茯砖茶产品及发酵功能菌对人体生理功能影响的研究不够全面透彻,消费者心存疑虑,这制约着产品的市场开发。解决这些问题的关键是继续深入研究茯砖茶发酵菌群特性和产品的生理功能,为茯砖茶产业提供强力的科技支撑,并为消费者解密茯砖茶所蕴涵的神奇奥妙。本研究的主要目标包括：茯砖茶发酵过程和产品样品中的真菌菌群结构分析,优势真菌的菌种鉴定,茯砖茶相关样品中蒽醌类衍生物的测定,茯砖茶干预肠出血性大肠杆菌0157：H7感染作用和冠突散囊菌对肠道菌群影响作用等。取得的研究结果分述如下：1茯砖茶中真菌菌群结构的解析从国内最大的茯砖茶生产商加工生产线上提取了茯砖茶渥堆样品、间隔两天的发酵样品,以及收集了黑毛茶、茯砖茶成品样品。运用传统的分离培养技术和新兴的PCR-DGGE技术研究这些样品中的真菌菌群结构。理化特性分析表明茯砖茶工业发酵过程为耐旱微生物生长提供了最适宜的环境条件。平板培养计数法表明散囊菌属是茯砖茶加工过程中的优势真菌。采用3对以真菌rDNA为靶标的通用引物,即NS1//GCfung5, su-0817-GC//ssu-1196和NL1F-GC//LS2R, PCR扩增样品的总DNA,再经DGGE电泳分离。结果比较显示以引物NL1F-GC//LS2R的PCR-DGGE图谱解析样品中的真菌菌群结构效果最好。通过PCR-DGGE分析发现至少有8个属的真菌：散囊菌属(Eurotium)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、曲霉属(Aspergillus)、轮枝孢属(Verticillium)、毕赤酵母属(Pichia)、拟盘多孢霉属(Pestalotiopsis)、根毛霉属(Rhizomucor)和白僵菌属(Beauvera),存在于所检测的茯砖茶相关的样品中。除了根毛霉属和白僵菌属,在茯砖茶发酵过程的样品中都能检测到其它6个属的DGGE印迹,其中散囊菌属、德巴利酵母属和曲霉属持续可见。耐旱真菌散囊菌属和德巴利酵母属是茯砖茶发酵过程中的优势真菌,曲霉属是次要的伴生菌。首次检测到德巴利酵母属参与茯砖茶发酵过程。首次显示轮枝孢属和根毛霉属在黑毛茶原料中大量存在。以及首次检测到白僵菌属存在于贮藏的茯砖茶成品中。白僵菌的存在可能与茯砖茶的长期保存有关,可以考虑利用安全微生物白僵菌防控茯砖茶成品的虫害。本研究获得了工业生产规模上茯砖茶发酵过程的真菌菌群结构PCR-DGGE指纹图谱,并为筛选用作茯砖茶发酵剂的功能菌指引了方向。2茯砖茶中分离的功能菌株的鉴定及系统发育分析菌种鉴定工作是工业菌种开发研究的重要基础。本实验针对从茯砖茶中分离纯化的菌株Eurotium sp. FZ,获得了其在培养基CZA30、CZA200和M40Y上生长的形态学特征,及其有性繁殖结构的显微特征和扫描电镜下子囊孢子的特征。依据形态学特征鉴定所测菌株的形态学种名为冠突散囊菌(Eurotium cristatum)。多位点序列分型(MLST)测定了4个基因位点,即ID区(rDNA中ITS1-5.8SrDNA-ITS2-28S rDNA D1/D2区)、RPB2(RNA聚合酶Ⅱ)、BT2(p-微管蛋白)和CF(钙调素)的DNA序列,提交到GenBank数据库中登记号分别为HQ148160、HQ148161、HQ148162和HQ148163。MLST技术鉴定所测菌株的系统发育种名为冠突散囊菌(Eurotium cristatum)。形态学特征鉴定方法和多位点序列分型方法的鉴定结果一致。对酵母菌株测定了ID区DNA序列,提交到GenBank数据库中登记号为JF710627。酵母菌株鉴定为汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)。该种酵母菌具有QPS身份,可用作开发茯砖茶混菌发酵剂的候选微生物。3茯砖茶相关样品中蒽醌类物质组分分析运用HPTLC方法检测了普洱茶、黑毛茶、茯砖茶、冠突散囊菌接种发酵的黑毛茶和冠突散囊菌菌体等5种样品中蒽醌类衍生物(大黄素、大黄素甲醚和大黄酚)的存在情况。在HPTLC实验条件下,三种标准样品即大黄素、大黄素甲醚和大黄酚得到有效地分离,其迁移率(Rf)分别是0.28、0.43和0.51。在430 nm下扫描条带的吸收峰和峰面积,表明所检样品中都存在大黄素,按相对含量递减排序是黑毛茶、普洱茶、冠突散囊菌接种发酵的黑毛茶、茯砖茶和冠突散囊菌菌体。可见大黄素在黑茶产品样品中普遍存在。所有样品中没有检出大黄酚。大黄素甲醚仅能从冠突散囊菌菌体和冠突散囊菌接种发酵的黑毛茶中检出。黑茶(包括茯砖茶)中蒽醌类物质(如大黄素)是茶叶消费者摄取膳食性蒽醌类物质的重要来源。4茯砖茶水提物对肠出血性大肠杆菌感染小鼠的干预通过给SPF级成年KM小鼠灌胃OD600=1.0左右新制的0157：H7细胞悬液,建立了受0157：H7感染的小鼠模型,新鲜粪便中0157：H7检测呈阳性,在行为活动上表现出疾病体征。实验设计5组小鼠：正常组、0157：H7感染模型组和茶汁干预治疗的低(日灌胃量1.0 g/kg)、中(10.0 g/kg)、高剂量组(20.0 g/kg),相当于成人(60kg)正常饮茶量(6.6g/d)及其10倍和20倍。从组织病理学、血液学、免疫学和肠道微生态学方面对实验小鼠进行了比较分析,结果发现：模型小鼠表现出典型的0157：H7感染疾病症状。对其组织病理学检查表明其胃、十二指肠、回肠、结肠和肾脏组织细胞结构都遭受损伤；血液学指标反映其肝、肾功能都受损害；免疫学指标反映其免疫系统受损,免疫力低下。低剂量茶汁对0157：H7感染有一定程度的康复促进作用。灌胃茶汁中、高剂量两组小鼠的所检测指标较模型组有所好转,恢复到正常组的水平甚至更优于正常组,表明合适剂量茯砖茶水提物对0157：H7感染机体引发的损害具有防护和修复作用。茯砖茶汁的抗0157：H7感染功能表现在：(1)维护肠道粘膜的完整性,(2)调整肠道菌群,(3)增强机体的免疫力和(4)保护肝脏和肾脏免受损害,保障其正常生理功能。由于中、高剂量组茶汁用量相当于成人(60kg)日饮茶量(6.6 g)的10倍和20倍剂量。外推到人体,提示日常饮用茯砖茶的10-20倍浓缩茶汤可能具有治疗0157：H7感染性腹泻的作用。研究结果为运用茯砖茶治疗0157：H7感染性腹泻提供了实验依据和理论参考。5冠突散囊菌菌体对小鼠结肠菌群的影响运用SPF级KM小鼠检验了冠突散囊菌的急性毒性,发现在最大耐受剂量10000 mg/kg灌胃情况下,小鼠未发生死亡病例。表明受试物冠突散囊菌对KM小鼠的经口急性毒性最大耐受剂量大于10000mg/kg。根据化合物经口急性毒性分级标准,小鼠一次经口LD50范围5001-15000mg/kg时属于2级毒性,为实际无毒物。实验设计4组小鼠：正常组、灌胃冠突散囊菌菌体水悬液的低(日灌胃量50mg/kg)、中(200 mg/kg)、高剂量组(1000 mg/kg)。灌胃组相当于成人(60 kg)每天消耗冠突散囊菌菌体0.33 g、1.32 g和6.6 g。运用PCR-DGGE技术检测了小鼠结肠中总体细菌、乳酸杆菌属、拟杆菌属和梭菌属Ⅳ簇的菌群结构,发现小鼠的结肠菌群结构上存在个体差异性。低剂量冠突散囊菌悬液引起小鼠结肠内的总体细菌、乳酸杆菌属和梭菌属Ⅳ簇的种群多样性增加,但对拟杆菌属的作用不明显。考虑到乳酸杆菌和梭菌属Ⅳ簇细菌具有健康促进作用,提示低剂量冠突散囊菌悬液可能具有调节肠道菌群功能。外推到人体,提示日常消耗0.33 g冠突散囊菌可能对人体肠道菌群具有调节作用。研究结果为冠突散囊菌菌剂制品的开发利用提供了实验依据。