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研究背景小耳畸形是最常见的先天性颅面畸形之一,主要表现为耳廓发育不良和软骨组织丢失,并常伴有听力缺失和颅面发育不全等,全球发病率为0.83-17.4/10000。随着高通量测序技术和生物信息学的发展,研究人员发现了一些与小耳综合征密切相关的易感基因,如HOXA2、MED12、TWIST1、GLI3、TBX15、TFAP2A等基因参与胚胎发育期间颅骨形态发生;ORC1、ORC4、ORC6、CDC6、SMAD4、CDK6、ATR与细胞周期信号通路显著相关;FLNA、ITGA7、LAMA2和COL6在ECM-受体相互作用和粘着斑形成中具有重要作用;FGFR2、FGFR3和ITGA7则被报道能够调节肌动蛋白骨架的重构。但无论是综合征型小耳畸形,还是散发的、非综合征型小耳畸形,我们对其致病机制都知之甚少。神经嵴细胞（Neural Crest Cells,NCCs）是胚胎发育过程中一群具有迁移能力的多能干细胞群,在颅面发育过程中能够分化发育形成包括软骨、骨、结缔组织和感觉神经节在内的多种组织器官。根据研究领域普遍认同的6小丘发育模型,构成耳廓组织的软骨细胞来源于迁移至第一、第二鳃弓（First and second branchial arches）的NCCs。随着胚胎发育和相应的形态变化,NCCs向小丘方向迁移并逐渐分化成间充质细胞、软骨祖细胞和软骨细胞,直至形成完善的耳廓形态。因此,对于形状复杂的外耳廓,精确的细胞迁移和定位是至关重要的。本实验室前期研究发现,与正常耳廓软骨细胞相比,来自小耳畸形组织的软骨细胞迁移能力不足。同时,由于小耳畸形通常表现为耳廓特征结构的缺失和耳朵尺寸的减小,我们推测细胞迁移能力不足可能是小耳畸形发生的主要细胞学基础,但具体机制仍有待阐明。细胞迁移是一个高度协调的动态生物学过程,调控胚胎发育过程中的形态发生,参与了大多数生理和病理过程,并在维持体内平衡中发挥重要作用。一般来说,它可以被简单概括为一个循环过程,包括细胞内外信号转导、信号通路激活、细胞极化、细胞骨架重排诱导的突出延伸、粘着斑形成、细胞外基质降解和形成迁移通道。对于大多数间质类细胞,迁移过程的起点是细胞极化,并区分胞体的前端和后端;随后,突出在迁移方向上延伸,诱导细胞定向运动。这一过程中的任一环节出现错误都会破坏整个循环,影响细胞功能和组织发育。多种运动相关基因/蛋白分别调控细胞运动的不同过程,并通过相互调节协调细胞行为。研究目的1.明确小耳畸形软骨细胞的迁移特征2.筛选影响小耳畸形软骨细胞迁移能力的关键基因3.Rac1在小耳畸形软骨细胞定向迁移中的作用和机制研究方法和结果1.人来源耳廓软骨细胞的迁移能力检测及迁移相关基因筛选方法:收集正常耳廓软骨组织和小耳畸形耳廓软骨组织样本,取材过程遵循中国医学科学院整形外科医院和北京协和医学院伦理委员会批准的准则,并获得书面知情同意书,所有组织样本用于实验研究。观察耳廓软骨组织的病理表现,并提取获得耳廓软骨细胞,通过划痕实验和Transwell实验比较小耳软骨细胞与正常耳软骨细胞迁移能力的差异。高内涵细胞成像系统和Cell IQ检测评估了包括细胞累计运动距离、迁移位移和平均运动速度等表征细胞运动能力指标,以及用来衡量细胞运动过程中在一定方向上持续性的迁移轨迹直线率和旋转角度等特征参数。进一步利用细胞运动PCR芯片定量检测迁移相关基因的表达,筛选差异基因,采用Real-time PCR和western blot进行验证。对划线后正在向划痕区域迁移的软骨细胞进行细胞骨架和差异基因的免疫荧光染色,观察细胞骨架蛋白和迁移相关蛋白的表达差异。结果:与正常耳廓软骨相比,小耳畸形软骨组织表现出明显的细胞排列不规则和细胞外纤维组织紊乱。划痕实验和Transwell实验均证明小耳软骨细胞迁移能力显著低于正常耳软骨细胞。高内涵成像分析和OrisTM细胞迁移实验证实了与正常耳软骨细胞相比,小耳软骨细胞的迁移位移明显降低,迁移轨迹直线率和偏转角度的离散度都较高,表明小耳畸形软骨细胞的迁移能力降低是以迁移方向持久性下降为特征。细胞运动PCR芯片、Real-time PCR和Western blot结果均证实Rac1、ENAH、VASP、MMP14和PXN在小耳软骨细胞中稳定低表达。免疫荧光染色结果则证明这些差异表达基因在小耳畸形软骨细胞中的定位同样存在异常。2.Rac1影响小耳软骨细胞定向迁移持久性的机制方法:利用免疫荧光染色、Western blot和Rac1 G-LISA Assay检测耳廓软骨细胞中不同构象的Rac1（总Rac1、Rac1-P、Rac1-GTP）的表达与分布。体外添加刺激后观察Rac1活化对小耳软骨细胞形态和迁移能力的影响,并构建Rac1的FRET生物传感器对小耳软骨细胞中的活性Rac1图谱进行表征。进一步利用Real-time PCR筛选出小耳软骨细胞中,Rac1上游表达异常的活性调节因子Rho GEF和Rho GAP。并构建Rac1,Rac1-Q61L和Tiam1的过表达载体,检测不同过表达处理后小耳软骨细胞定向迁移能力的变化。结果:不同构象的Rac1（总Rac1、Rac1-P、Rac1-GTP）在小耳软骨细胞中的表达不足,且总Rac1异常地弥散性分布在小耳软骨细胞的胞浆中,Rac1-P则大量出现在细胞核中,而Rac1-GTP虽然在细胞突起前缘聚集,但与细胞骨架的重构表现出明显的不同步。添加激活剂刺激Rac1活性后,小耳软骨细胞定向迁移能力明显提升。且FRET结果显示,刺激Rac1活性后小耳软骨细胞形态发生显著变化,FRET效率从 10%-14%上调至 15%-23%。此外,包括TIAM1、ARHGEF12、ABR 和ARHGAP19等多个Rho GEF和Rho GAP家族成员在小耳软骨细胞中表达降低,表明小耳软骨细胞中的Rac1上游活化机制存在缺陷。过表达Rac1-Q61L和Rac1特异性活化因子Tiam1均能部分挽救小耳软骨细胞的定向迁移能力缺陷,而过表达Rac1则无法达到这一效果。3.Tiam1-Rac1通路在小耳畸形鼠模型中的验证方法:在小耳畸形模型鼠（Bmp5se/J和Prkralear-3J/GrsrJ）中检测畸形耳廓软骨组织的细胞和细胞外基质分布情况,并验证Tiam1和Rac1在疾病模型鼠中的表达。利用CRISPR-Cas9技术构建基因缺陷小鼠,在胚胎发育过程中诱导Rac1的软骨特异性表达缺陷,并观察新生鼠的发育表型。结果:Bmp5se/J和Prkralear-3J/GrsrJ的纯合突变个体均表现出耳廓软骨组织的紊乱,tiam1的表达缺陷,以及活性rac1的表达不足,提示tiam1-rac1的异常表达模式在小耳畸形模型鼠中同样存在。此外,我们构建得到Rac1flox+/+ CreERT Sox9和Rac1flox+/+ CreERTCol2a1小鼠个体,但妊娠早期的他莫昔芬干预严重影响胚胎发育,阻碍了我们对于Rac1影响耳廓发育的观察。研究结论1.小耳软骨细胞的迁移能力较正常耳软骨细胞降低,具体表现为细胞的定向迁移持久性下降。2.RAC1、ENAH、VASP、MMP14、PXN等迁移相关基因/蛋白在小耳软骨细胞中表达降低,并且与其在正常软骨细胞中呈极性分布不同,在小耳软骨细胞中弥散分布。3.不同构象的Rac1在正常耳软骨细胞和小耳软骨细胞中的表达和定位存在差异,其中活性Rac1（Rac1-GTP）在小耳畸形软骨细胞中的表达显著降低。4.多个调节Rac1活性的Rho GEF和Rho GAP在小耳软骨细胞中显著低表达。其中Tiam1作为Rac1特异性的Rho GEF,过表达Tiam1能够显著提高Rac1-GTP的水平和小耳软骨细胞定向迁移的持久性。5.在小耳畸形疾病模型鼠中同样可以观察到耳廓软骨组织的排列紊乱和Tiam1诱导的Rac1活化不足。