骨髓间充质干细胞(BMSCs),又称为骨髓基质干细胞,是一种存在于骨髓中的成体干细胞,具有向肌肉、骨骼、神经等多个方向分化的潜能。有研究表明,可以利用BMSCs脑内移植治疗帕金森病(PD)等神经退行性疾病。据推测,这种治疗作用可能是通过BMSCs在脑内向神经元样细胞分化,从而替代损伤的神经元细胞发挥作用而实现。但BMSCs定向分化规律尚缺乏系统的实验研究。本研究通过BMSCs的体外扩增,并进行向神经元样细胞分化的诱导,通过检测神经元样细胞特异性标记等研究,探索BMSCs向神经元样细胞分化的规律和移植治疗诸如帕金森等神经退行性疾病的机制,为该类疾病的细胞及其基因治疗研究提供实验依据。帕金森病是一种常见的中枢神经系统神经元变性、凋亡和包涵体的产生为主要病理特征的神经退行性疾病。目前,利用动物模型研究帕金森病的实验,主要在整体水平观察帕金森病的行为学改变及组织学上的病理特征,较难深入掌握其发病的细胞学和分子学机制,在一定程度上制约了药物治疗等控制措施的研究进展。而成功的构建帕金森病细胞模型可以弥补上述不足。帕金森病细胞模型的成功要求细胞出现凋亡和产生包涵体即(Lewy小体)。帕金森病细胞模型可以从细胞水平方面研究细胞各个指标的变化。本实验建立帕金森病体外细胞模型,模拟人类帕金森病的两大病理特征,深入地研究帕金森病分了水平上的各项变化,为移植治疗药物筛选提供技术平台。帕金森病细胞模型从细胞水平上探讨帕金森病的发病机制,研究细胞生物学特性的变化,对于帕金森病动物模型中的神经细胞,细胞水平上的发病机制具有启示作用。BMSCs移植治疗帕金森病在细胞水平上的机理研究与帕金森病细胞模型相关,为今后的移植治疗与药物治疗奠定一定的基础。实验一：大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的研究体外分离纯化的大鼠BMSCs,通过定向诱导技术,掌握其分化为神经元样细胞的条件和变化规律,为BMSCs移植治疗神经退行性疾病的技术程序及作用机理研究提供实验依据。以全骨髓冲洗法获得大鼠BMSCs;将获得的BMSCs,接种全骨髓培养；贴壁培养法纯化BMSCs; BMSCs传代消化,绘制细胞的生长曲线；流式细胞术检测细胞表面特异因了；诱导剂诱导,对BMSCs进行向神经元样细胞分化的诱导,通过显微镜观察细胞的形态学变化,并以免疫细胞化学染色法检测被诱导细胞神经元特异性标志nestin、NSE和GFAP的表达,验证BMSCs向神经元样细胞分化的潜能。以全骨髓贴壁法纯化培养的BMSCs,贴壁生长良好,传代后,BMSCs生长曲线为S形；流式细胞术检测细胞表面特异因子阳性表达率很高,符合BMSCs表面抗原的特征；细胞免疫化学染色显示诱导后细胞的nestin和NSE阳性,GFAP阴性,说明体外诱导的细胞表达神经元特异性烯醇化酶和神经干细胞的特异性标志物,不表达胶质纤维酸性蛋白,提示在体外被诱导的细胞表达神经元样细胞的特异性标志物。体外分离纯化的BMSCs,细胞表面标志符合BMSCs特征,提示贴壁培养法可以获得高纯度的BMSCs。在一定的条件下,BMSCs在体外可以被诱导分化为神经元样细胞,说明BMSCs具有向神经元样细胞分化的潜能,提示BMSCs有替代神经细胞移植治疗帕金森病的可能。实验二：帕金森病细胞模型的建立以PC12细胞为对象,经适当处理,建立可用作帕金森病相关研究的PD细胞模型。建立PC12细胞稳定的培养体系,绘制细胞生长曲线；不同浓度的MPP+处理PC12细胞,比较不同浓度的MPP+对PC12细胞活力的影响,选择最适宜的MPP+浓度；以细胞活力、细胞凋亡和特异性蛋白a-synuclein为指标,检测PD细胞模型的构建情况。以MTT法检测细胞活力,以Hoechst33342荧光染色观察细胞凋亡,通过AO和EB染色法检测细胞凋亡率,免疫荧光染色法检测特异性蛋白a-synuclein勺存在。培养体系稳定、操作简单,细胞贴壁迅速,活力较高,细胞生长曲线呈S形。不同浓度的MPP+对PC12细胞的影响不同,随着MPP+浓度的增加,PC12细胞活力降低,当MPP+浓度高于500μM时,PC12细胞活力不再显著降低。Hoechst33342荧光染色观察凋亡的细胞出现蓝色的荧光碎片；AO和EB染色法可观察到明显的细胞凋亡,实验组细胞凋亡率达明显高于对照组。经处理的PC12细胞表达特异性蛋白a-synuclein。 MPP+处理PC12细胞,细胞表现出细胞凋亡和包涵体出现的PD两大病理特征,同时还表达PD特有的a-synuclein蛋白。说明本实验成功建立了PD细胞模型。