本文采用非破坏性荧光分析方法和荧光成像技术,设计了核壳生物聚合物用于端粒酶的活性检测,构建了基于核酸分子聚集体的细胞内靶标成像技术、基于端粒酶延长的DNA滚环复制反应,基于双靶向交叉探针和滚环复制放大策略,实现了对还原型谷胱甘肽(GSH)、miRNA等肿瘤标志物的高灵敏、高特异性检测。主要内容包含以下几个方面:1.设计了S-S键分子探针,该探针进入肿瘤细胞,通过thiol-disulfide交换反应,引发DNA杂交链式反应,形成荧光富集物,实现了肿瘤细胞内GSH的高灵敏检测。以肝癌细胞(HepG2)为研究对象,实时监控成像实验表明:GSH激发了细胞内的thiol-disulfide交换反应,触发DNA杂交链式反应,生成有序核酸分子富集体。GSH作为一种活性小分子,在恶性肿瘤细胞的细胞质中含量偏高,可用于区分肿瘤细胞和正常细胞。GSH通过Thiol-Disulfide交换反应可切断核酸探针上的双硫键,进而触发细胞内DNA与信号分子探针发生链式杂交反应,其杂交产物在功能化纳米二氧化硅材料上形成有序的核酸分子聚集体,从而实现检测信号的放大和聚集,对单个细胞内GSH可以进行有效的监测,并初步实现了对肿瘤细胞和正常细胞的识别。这种单细胞分析的方法,颈环探针(修饰猝灭基团BHQ和荧光基团FAM)处于荧光猝灭状态;当GSH引发DNA链式杂交反应后,猝灭效应减小,荧光恢复;HCR产物自组装在介孔硅纳米球上,形成有序的核酸分子聚集体,可用于GSH的检测及细胞内成像分析。自组装核酸分子堆积体可在单细胞内聚集并在单个癌细胞内产生富集的荧光斑点,因此可有效地区别癌细胞和正常细胞。2.设计了功能化金纳米探针,通过端粒延长引发细胞内复制放大反应,形成以氧化硅纳米花为核心的生物聚集体,从而实现了肿瘤细胞内端粒酶的原位检测、单细胞内信号分子的聚集和靶向释放抗癌药物。实验结果表明:肝癌、乳腺癌和宫颈癌这三种细胞可观察到聚集的FAM荧光,同时释放药物DOX;而正常肝细胞几乎没有聚集FAM斑点,释放药物量也非常少。这种靶向肿瘤细胞、释放药物的方法,可以减少对正常细胞的损伤。构建了一种双功能的纳米探针,该探针具有靶向细胞内端粒酶和释放药物的性能。同时,基于端粒延长释放引物,可在细胞内实现滚环复制放大反应,并形成一种以氧化硅纳米花为核心的荧光生物聚集体,从而实现肿瘤细胞内端粒酶的原位检测和单个细胞内信号分子的聚集,同时靶向释放抗癌药物。人类端粒酶是一种独特的核糖核蛋白,能够延长端粒3’末端的重复序列TTAGGG。在正常细胞内,在每一次复制周期后端粒是逐步缩短的,然而,由于活性肿瘤细胞中端粒酶的上调或激活,端粒长度可以被保持在人类癌细胞内,进而允许这些细胞增殖和存活。该技术利用聚集荧光信号技术检测肿瘤细胞内端粒酶的活性,并且可以靶向释放抗癌药物,有效减少对正常细胞的损伤。3.设计了双靶向功能探针:以细胞内的肿瘤标志物miRNA为靶标,监测细胞内两种基因组分的表达变化。这种交叉探针在肿瘤细胞内可激发双向滚环复制反应,通过静电自组装,形成双信号荧光纳米簇。对肿瘤细胞内基因组分做了提取实验,数据显示:该方法对miR21和let7a两种组分的检测,具有很好的特异识别性和灵敏度。对不同细胞做了成像对比,实验发现:三种肿瘤细胞内可以形成双信号荧光团簇;而在正常细胞内只能形成单信号团簇。原因是:在正常细胞内,miR21处于低表达状态,let7a处于高表达状态。这种双信号识别方法有助于进一步提高肿瘤疾病早期诊断。