背景与目的膀胱尿路上皮癌（简称膀胱癌）是我国发病率最高的泌尿系统肿瘤,其生物学行为复杂、易复发和进展,化疗药物抵抗是其临床治疗失败的主要原因之一。微小核糖核酸（microRNA,miRNA）是一种非蛋白编码基因转录、高度保守的内源性小RNA分子,通过与靶mRNA的3’非翻译区（3’untranslated region,3’UTR）特异性结合,降解mRNA或抑制其翻译,阻碍靶蛋白的合成。在肿瘤发生发展过程中,miRNA表达水平可发生改变,肿瘤生物学行为受到影响。miR-31是一种具有多重角色的miRNA分子,在不同肿瘤中可发挥促癌或抑癌作用,然而在膀胱癌中,其确切作用机理尚不明确。为此,本研究将在组织、细胞和动物水平,分析miR-31在膀胱癌中的表达特征和生物学作用,揭示miR-31调节膀胱癌生物学行为和化疗敏感性的作用机制,以期加深对膀胱癌发生、发展机理的认识,为探索提高膀胱癌化疗效果的新方法提供科学依据。材料与方法1.收集非肌层浸润性膀胱癌（Nonmuscle invasive bladder cancer,NMIBC）和肌层浸润性膀胱癌（Muscle invasive bladder cancer,MIBC）患者的手术标本,采用荧光实时定量PCR检测肿瘤组织与邻近正常尿路上皮中miR-31的表达情况。2.利用lipofectamine 2000转染试剂,对T24和5637膀胱癌细胞转染miR-31模拟物（mimics）或对照小RNA（miR-NC mimics）,观察miR-31表达对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭和细胞周期的影响。3.构建整合素α5（Integrin α5,ITGA5）3’UTR的双萤光素酶报告基因载体,将其与miR-31 mimics（或miR-NC mimics）共转染T24细胞,根据萤光素酶活性鉴定 ITGA5 是否为 miR-31 的靶基因;miR-31 mimics（或 miR-NC mimics）转染T24和5637细胞,western blot检测ITGA5蛋白表达;构建ITGA5过表达质粒,将其（或空白质粒）与miR-31 mimics（或miR-NC mimics）共转染,观察miR-31/ITGA5对膀胱癌细胞增殖的影响。4.收集ITGA5过表达质粒（或空白质粒）与miR-31 mimics（或miR-NC mimics）共转染的T24和5637细胞,接种至纤维连接蛋白包被的培养板,以丝裂霉素C（Mitomycin-C,MMC）处理细胞,检测MMC的细胞毒性和膀胱癌细胞凋亡;收集各组细胞蛋白,检测miR-3 1/ITGA5对Akt和Erk信号通路的调控作用。5.制备人miR-31基因重组慢病毒,感染T24细胞后筛选稳定过表达miR-31的细胞株,构建裸鼠皮下移植瘤动物模型,体内研究miR-31对膀胱癌生长和MMC化疗效果的影响。研究结果1.与正常尿路上皮相比,miR-31在MIBC和NMIBC组织中的表达均显著下调;与NMIBC相比,MIBC组织的miR-31表达水平更低。2.miR-31过表达可抑制T24和5367细胞的增殖,阻碍G1→S期转变的分裂周期,并抑制细胞的迁移和侵袭。3.T24细胞中,miR-31 mimics转染可降低野生型ITGA5 3’UTR报告基因载体的萤光素酶活性,而对突变型ITGA5 3’UTR载体的萤光素酶活性没有明显影响;miR-31过表达后,T24和5367细胞中ITGA5蛋白表达显著下调;ITGA5质粒与miR-31 mimics共转染可逆转miR-31表达对膀胱癌细胞增殖的抑制作用。4.miR-31过表达可增强MMC对膀胱癌细胞的毒性,促进MMC诱导的细胞凋亡,而miR-31与ITGA5同时表达可逆转上述化疗增敏作用;MMC处理后,与对照组相比,miR-31过表达细胞中Akt和Erk的磷酸化受到抑制,而ITGA5与miR-31共表达细胞中Akt和Erk磷酸化水平与对照组相似。5.裸鼠移植瘤实验显示,miR-31过表达可显著抑制膀胱癌在体内的生长,抑制肿瘤组织ITGA5蛋白的表达,提高MMC的化疗效果。研究结论1.膀胱癌组织中miR-31表达降低,在浸润更深的MIBC肿瘤中下调更加显著。2.miR-31可抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭,阻碍细胞分裂周期,提高膀胱癌对化疗药物MMC的敏感性。3.膀胱癌细胞中,ITGA5是miR-31的靶基因,miR-31可通过下调ITGA5发挥负性调控作用;miR-31通过抑制ITGA5蛋白表达削弱了细胞内Akt和Erk信号通路的活化,抑制细胞黏附介导的药物抵抗,提高膀胱癌的化疗敏感性。