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背景:CAR-T免疫治疗是指经嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)修饰的T细胞识别、结合肿瘤抗原,启动特异性肿瘤杀伤效应的免疫疗法。近年来,CAR-T免疫治疗在血液瘤的临床治疗中表现出良好的效果,但在实体瘤中的效果却并不显著。研究发现CAR-T细胞由于缺乏降解细胞外基质(ECM)的主要成分,包括硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)的乙酰肝素酶(HPSE)而阻碍了其在实体瘤中的治疗效果。目的:本研究结合实体瘤所处的低氧环境,设计构建HRE/CMV启动子低氧调控HPSE重组慢病毒,并与HER2/CAR共感染T细胞,在增强其穿过ECM对HER2+肿瘤细胞特异性杀伤的同时降低对正常组织的损伤,从而提高CAR-T细胞对实体瘤的治疗效果。方法:首先,利用分子生物学技术,构建三种pCDH-HREs/CMV-HPSE重组慢病毒质粒,转染至293T细胞,Western blot检测HPSE在293T细胞中的表达情况。初步研究低氧能否诱导HPSE表达并选择一种诱导效果最佳的慢病毒质粒包装成慢病毒颗粒。构建第三代靶向HER2嵌合抗原受体,克隆至慢病毒载体并包装成慢病毒颗粒。然后,采用流式细胞术测定病毒滴度及对T细胞的感染效率,并检测HER2在肿瘤细胞表面的表达情况。通过Western blot检测HRE6-HER2/CAR-T中HPSE的低氧诱导表达情况。其次,细胞毒性实验测定HRE6-HER2/CAR-T对HER2+肿瘤细胞的特异性杀伤作用,并通过ELISA法检测IFN-γ的释放情况。通过Transwell细胞侵袭实验与细胞毒性实验相结合,检测在实体瘤的低氧条件下,HRE6-HER2/CAR-T穿过ECM对HER2+肿瘤细胞的特异性杀伤作用。结果:成功构建pCDH-HREs/CMV-HPSE重组慢病毒质粒。低氧能够有效诱导HPSE在293T细胞中的表达,并且pCDH-HRE6/CMV-HPSE的诱导效果最佳。成功构建第三代靶向HER2嵌合抗原受体慢病毒载体pCDH-HER2/CAR。流式细胞术测得HRE6,HER2/CAR病毒滴度分别为3.5×107 TU/mL,4.5×107 TU/mL;HRE6-T,HER2/CAR-T的感染效率分别为45.3%,49.8%;人乳腺癌细胞SKBR3高表达HER2,MCF-7中度表达HER2,MDA-MB-231低表达HER2;HRE6-HER2/CAR-T共感染效率为13.4%。低氧能够有效诱导HPSE在HRE6-HER2/CAR-T 中的表达。HER2/CAR-T 与 HRE6-HER2/CAR-T 在体外均能够特异性杀伤HER2+肿瘤细胞SKBR3,并释放出大量的IFN-γ。在低氧和ECM存在的模拟实体瘤微环境下,HRE6-HER2/CAR-T能够穿过ECM,并对HER2+肿瘤细胞SKBR3进行特异性杀伤。结论:在低氧和ECM存在的模拟实体瘤微环境下,HRE6-HER2/CAR-T能够穿过ECM,并特异性杀伤HER2+肿瘤细胞。本研究为CAR-T免疫治疗实体瘤提供了新的可能性,并积累了初步的实验数据,为后续的体内研究奠定了基础。