木薯(Manihot esculenta Crantz)属大戟科(Euphorbiaceae)木薯属(Manihot P.Mill.)植物,是世界三大薯类作物之一,有“地下粮仓”、“淀粉之王”、“特用作物”之誉称。木薯起源于热带美洲,喜高温,不耐霜冻,一年中有8个月以上无霜期,年平均温度18℃以上的地方均可栽培。当温度低于15℃时,植株容易受到寒害;当今温度在0℃以下时,植株体内细胞活动几乎停止,生长点被冻伤。因此,了解木薯耐寒性的生理基础和分子机制具有重要意义。本研究以木薯SC8和MS5为实验材料,从生理生化、RNA和蛋白质表达水平方面,分析低温胁迫下木薯幼苗渗透调节物质、抗氧化酶活性、差异蛋白的表达特性、基因转录等方面的变化及相互关系,主要结果如下:(一)生理指标动态变化分析:(1)木薯种质SC8和MS5在5℃低温胁迫下,随着胁迫时间的延长,叶片的相对电导率、可溶性糖、MDA含量呈不断上升趋势,而可溶性蛋白、脯氨酸含量、SOD、POD呈先上升后下降的变化趋势。(2)低温胁迫下,木薯叶片相对电导率与丙二醛含量和可溶性糖含量呈极显著正相关,与SOD活性和可溶性蛋白含量呈极显著负相关。可溶性蛋白含量与丙二醛含量呈显著负相关,与游离脯氨酸含量、SOD活性、POD活性呈极显著正相关。SOD活性与可溶性糖含量呈极显著负相关,与POD活性呈极显著正相关。(3)主成分分析显示相对电导率、SOD活性和可溶性蛋白含量在3个主成分中占有最大的信息量,与木薯耐寒性关系密切,可作为评价木薯耐寒性强弱的主要生理指标,其次是游离脯氨酸含量、POD活性、可溶性糖含量和丙二醛含量。综合分析结果显示木薯MS5的耐寒性高于SC8。(二)7个转录组测序数据分析:(1)根据木薯基因组AM560共注释到的47,443个转录本,将多外显子木薯转录本基于共用可变剪切位点进行聚类,单外显子木薯转录本根据彼此之间在基因组上的定位重叠信息进行聚类,共得到43,277个基因。(2)基因表达谱聚类分析发现,叶片通过调控基因的表达来应对低温胁迫,表现在转录组的动态变化中。两份种质经过低温胁迫后基因表达数量都比常温时明显增多,增加表达的基因有高表达基因,也有低表达基因。木薯SC8叶片在5℃低温处理7天条件下比常温条件下开启了更多的低表达基因的表达;而在低温处理后恢复常温条件时,则关闭了更多的低表达基因,同时开启了更多高表达基因的表达。木薯MS5叶片在5℃低温处理7天条件下比常温条件下开启了更多的低表达基因的表达;而在低温处理后恢复常温条件时,则关闭了更多的高表达基因,同时开启了更多低表达基因的表达。(3)基因差异表达分析发现温度条件的改变体现在基因的表达调控上,SC8和MS5叶片中参与低温胁迫调控的基因数从常温到低温到恢复常温分别是7009/8273个和6751/6343个,其中有4060个基因在叶片中普遍参与不同温度的调节,这些基因可能是温度对叶片转录组的基本调节。两者的转录组相比,MS5比SC8叶片中参与低温胁迫调控的基因数量更少,说明不同种质在低温胁迫中参与基因调控的多少,最终体现在种质个体之间的耐寒性差异。(4)差异基因表达模式聚类表明木薯转录组的调控主要与试验条件相关(低温胁迫),相同试验条件的材料最初聚在一类,其次才是试验材料来源的差异。(5)GO功能富集分析获得生物过程、细胞组分和分子功能3大类型16分支。相同试验条件下基因调控的方向一致,也表现在其调控基因的功能上。不同实验条件下差异表达的基因均在膜封闭腔、金属伴侣活性、解剖结构的形成、细胞、细胞部分、大分子化合物、细胞器、细胞器部分、代谢过程等9种功能上富集;低温胁迫时调控的基因在营养库活性上富集;低温胁迫时调控的基因和不同实验条件下调控的基因则在生长过程上发生富集。(6)KEGG分析结果一共获得13个差异表达基因的代谢富集通路。其中在不同实验条件下差异表达基因都富集的有RNA运输、核糖体生物起源、光合生物体固氮、剪接体、光合作用天线蛋白、核糖体、光合作用和碳代谢等8个通路;二羧酸代谢和Legionellosis通路则在不同实验条件下基本上都富集;雌激素信号和甲烷代谢则在低温胁迫后到恢复常温时有富集;蛋白酶体则在叶片中发生低温胁迫时和叶片不同实验条件下发生调控的基因中富集。(7)自由基和活性氧的转录组数据分析发现,木薯在低温胁迫时,MS5叶片中的APX活性并没有被抑制,而SC8叶片中则发生了明显的抑制。APX活性在木薯响应低温胁迫中发挥了非常重要的作用,其活性的强弱直接体现在种质之间的耐寒性差异上。(三)蛋白质组分析:(1)低温诱导SC8叶片后发现有42个差异表达水平在2.0倍以上蛋白点,其中上调点有11个,下调点有31个。成功鉴定到其中的37个蛋白,包括11个上调点及26个下调点。这些差异蛋白质涉及光合作用、能量代谢、分子伴侣、蛋白质合成、防御、氨基酸代谢、抗氧化、DNA结合蛋白、无机离子运输和代谢、信号转导等10个功能群,此外还包括2个未知功能蛋白。(2)低温诱导MS5叶片后发现有59差异表达水平在2.0倍以上蛋白点,其中上调点有10个,下调点有49个。成功鉴定到其中的52个蛋白,包括10个上调点及42个下调点。这些差异蛋白质涉及光合作用、能量代谢、蛋白质合成、防御、抗氧化、信号转导、分子伴侣、DNA结合蛋白、无机离子运输和代谢、氨基酸代谢等10个功能群和有5个未知功能蛋白。(3)比较两者之间的低温诱导蛋白发现有34个差异蛋白质点在两份样品中共同表达,其中9个点上调,29个点下调,且同一蛋白质点在两份木薯种质中的表达特性完全相同(都上调或都下调)。这些共同表达的差异蛋白质主要涉及到光合作用、碳代谢与能量代谢、蛋白质合成、氨基酸代谢、分子伴侣、细胞防御、无机离子运输和DNA结合蛋白等8个功能类型和2个生物功能未知蛋白。有3个差异蛋白质点仅在SC8中表达并涉及光合作用、能量代谢和信号传导等3个功能类型。有18个差异蛋白质点仅在MS5中表达并涉及光合作用、能量代谢、蛋白质合成、防御、抗氧化、信号传导和分子伴侣等7个功能类型和3个功能未知蛋白。综上所述,本研究以生理学为基础,利用转绿组学和蛋白质组方法分析了木薯低温胁迫的分子机制,并从中获得了海量的信息,但本研究对于转录组学研究和蛋白组学研究尚未进入最后阶段,需要将质谱数据与转录组学数据进行综合分析,对所得到的分析结果进行进一步的推理、验证和分析。这些结果不仅丰富了木薯低温胁迫的分子机理,也为综合利用转绿组学和蛋白质组方法挖掘木薯耐寒基因和蛋白质提供了新的方法。