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为适应自然环境中不断变化的光照条件,光合生物可以通过状态转换来调节激发能在PSⅠ和PSⅡ之间的平衡。状态转换是植物短时适应的一种重要调控机制,主要是通过PSⅡ主要捕光色素蛋白复合体(LHCⅡ)的可逆磷酸化来实现。高等植物中,LHCⅡ三体是由3种亚基蛋白组成,即Lhcb1、Lhcb2和Lhcb3,其中只有Lhcb1和Lhcb2蛋白能在状态转换过程中发生磷酸化。我们在对低光诱导的豌豆类囊体膜蛋白磷酸化研究中发现,与Lhcb1相比,Lhcb2蛋白表现出更快的磷酸化速率。为了加深对Lhcb1、Lhcb2蛋白磷酸化速率调控分子机制的了解,以及更深入的研究LHCⅡ亚基蛋白与激酶的作用机制,我们利用拟南芥/豌豆体内类囊体膜及体外豌豆天线重组两个体系研究了LHCⅡ不同亚基的磷酸化规律。并通过体外重组的方法获得了LHCⅡ亚基蛋白不同突变体的色素蛋白复合体,结合分离得到的STN7激酶进行了体外磷酸化实验,系统地研究了LHCⅡ亚基蛋白与激酶之间的相互作用。由于之前对磷酸化LHCⅡ蛋白的构象变化也鲜有报道,因此本研究还比较了磷酸化天线和非磷酸化天线的各种光谱特性。主要研究结果如下: 1)LHCⅡ不同蛋白亚基表现出不同的磷酸化动力学:不论是低光诱导的磷酸化,还是其他处理条件,如高温和低温诱导的磷酸化,Lhcb2的体内磷酸化速率都快于Lhcb1的磷酸化速率。 2)本试验从豌豆类囊体膜中分离了STN7激酶复合物,并建立了STN7激酶对体外重组LHCⅡ进行磷酸化反应的体外磷酸化体系,该体系的磷酸化反应符合酶促反应动力学规律。 3)利用STN7激酶磷酸化体系,对LHCⅡ的不同亚基进行了磷酸化处理,发现Lhcb1色素蛋白复合体单体和三体都可以被所分离的STN7激酶磷酸化;而Lhcb2蛋白(包括体外重组和由类囊体膜分离提取的LHCⅡ中的Lhcb2)不能被磷酸化。并且,通过不同物种来源的STN7/STT7激酶体外磷酸化实验发现激酶这一特异性底物识别现象是普遍存在的。这些结果揭示了Lhcb1和Lhcb2可能存在不同的磷酸化机制。 4)通过蛋白序列比对分析发现,LHCⅡ不同亚基的N-端序列存在差异,将Lhcb1与Lhcb2蛋白的N端序列互换获得了Lhcb1-N2和Lhcb2-N1突变体蛋白。通过LHCⅡ不同突变体的体外磷酸化证明,STN7激酶不同催化机制的关键是蛋白的N端序列,因为,Lhcb2-N1蛋白实现了磷酸化,而Lhcb1-N2却不能被磷酸化。此外,Lhcb2蛋白N端肽链加长实验发现,Lhcb2蛋白N端肽链增加两个Ala后所得到的突变体蛋白Lhcb2-AA也能够被磷酸化。因此,Lhcb蛋白N端磷酸化位点之前肽链的长度对实现激酶与底物的相互作用至关重要。 5)通过对Lhcb1蛋白N端序列和STN7激酶活性结构域的分析,并结合Lhcb1蛋白N端带正电荷氨基酸残基的突变实验,发现Lhcb蛋白N端带正电荷氨基酸对激酶与底物的结合有重要作用。 6)不同物种Lhcb1与Lhcb2蛋白序列比对发现了蛋白N端存在一个很保守的序列差异,即Lhcb1的前两位氨基酸为RK而Lhcb2的前两位氨基酸为RR。通过第二位氨基酸交换实验证明Lhcb蛋白N端序列的前两位氨基酸残基对其磷酸化速率有重要作用:将Lhcb1的第二位氨基酸K替换成R后,其磷酸化速率显著上升;而将Lhcb2-AA的第二位氨基酸R替换成K后,其磷酸化速率显著降低。 以上结果表明,LHCⅡ亚基蛋白N端磷酸化位点之前肽链的长度、带正电荷的氨基酸残基以及N端氨基酸的组成和构型都对其与激酶的相互识别具有重要作用。与Lhcb1蛋白相比,Lhcb2蛋白的磷酸化调控机制更复杂,其对反应条件的变化更敏感。Lhcb2蛋白的这些磷酸化特性可能与其在状态转换过程中的特殊功能相关。