氨溴索联合左氧对肺炎克雷伯菌生物膜的研究

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目的:1.研究多重耐药性肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,KP)生物膜形成的能力,旨在为临床拮抗肺炎克雷伯菌生物被膜提供理论依据。2.研究氨溴索联合左氧氟沙星(Levofloxacin,LVF)对多重耐药性肺炎克雷伯菌生物被膜的形成抑制和清除作用,旨在为临床提供拮抗肺炎克雷伯菌生物膜形成和治疗的新策略。方法:1.收集皖南医学院第一附属医院经VITEK-2 Compact 60细菌鉴定仪鉴定的肺炎克雷伯菌45株,将其分为敏感组、产超广谱β-内酰胺酶组(Extended spectrum beta-lactamase,ESBLs)和耐碳青霉烯类组(Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP),每组各15株,采用结晶紫染色法进行生物被膜半定量检测。2.从各组中选取3株生物被膜产量相近的菌株,采用微量肉汤稀释法测定氨溴索和左氧氟沙星对肺炎克雷伯菌的最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC);棋盘稀释法测定不同浓度氨溴索对左氧氟沙星MIC的影响以及通过计算部分抑菌浓度指数(Fractional inhibitory concentration,FIC)判断联合效果和选择最佳协同浓度。3.采用结晶紫法联合激光扫描共聚焦荧光显微镜(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)研究不同浓度药物对肺炎克雷伯菌生物被膜的形成抑制试验和清除试验。结果:1.三组细菌生物被膜均在第5天达到成熟,通过两两比较发现敏感组较ESBLs组和CRKP组更易形成生物被膜且产量更多(F=3.725,P=0.032)。2.棋盘稀释法显示,随着氨溴索浓度的增加,3组细菌左氧氟沙星MIC值的几何均数均明显下降,呈显著的负相关,且相关系数分别为-0.531(敏感组)、-0.876(ESBLs组)、-0.907(CRKP组)。3.通过对各实验组KP两药联合药敏结果分析发现,3组菌两药联合时的MIC值比单药所测MIC值呈现不同程度的减小(P<0.05)。且各菌FIC指数计算结果均≤0.5,两药联合均呈现协同作用。4.在生物被膜形成抑制试验中,3组菌在单用氨溴索时,随着氨溴索浓度递增,生物被膜产量逐渐减少,直到氨溴索浓度达到1.875mg/ml时,其抑制率与3.75mg/ml没有差异。药物对生物被膜形成的抑制率均达到了75%以上(氨溴索为0.95mg/ml浓度时,各组抑制率分别为敏感组:75.32%,ESBLs组:91.09%,CRKP组:90.42%)。且3组菌在协同浓度时,抑制率均达到了85%以上(协同浓度时,各组抑制率分别为敏感组:86.18%,ESBLs组:85.23%,CRKP:91.56%)。5.生物被膜达到第5天成熟后加药培养24h发现,随着氨溴索药物浓度的增加,生物被膜清除率逐渐递增,但是生物被膜清除并不够彻底,甚至在氨溴索浓度达到3.75mg/ml时,生物被膜清除率仍未达到70%(氨溴索浓度为3.75mg/ml时,生物被膜清除率分别为敏感组:69.95%,ESBLs组:62.81%,CRKP组:66.77%),3组菌在协同浓度组也未见明显的清除效果,各组的清除率分别为敏感组:41.65%,ESBLs组:46.14%,CRKP组:39.77%。其清除率与0.49mg/ml、0.95mg/ml氨溴索组、和MIC左氧氟沙星组之间无明显差异(P>0.05)。结论:1.敏感组较ESBLs组和CRKP组更易形成生物被膜且产量更多。2.氨溴索对肺炎克雷伯菌生物被膜的形成具有很好的早期抑制作用,与左氧氟沙星联用可以提高其杀菌能力。为临床预防和治疗产生物被膜的肺炎克雷伯菌感染提供了新的思路。3.研究结果显示预防和治疗产生物被膜的肺炎克雷伯菌感染最佳协同浓度为0.49mg/ml氨溴索+4μg/ml左氧氟沙星。
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