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目的:本课题旨在利用噬菌体随机多肽文库对小鼠进行体内筛选,获得小鼠肾脏血管特异性多肽。
方法:1、小鼠的体内筛选实验动物为6-8周的SPF级雌性Balb/c鼠,乙醚麻醉小鼠后尾静脉注射C7C噬菌体多肽文库200μl,循环10分钟后,将小鼠再次麻醉,打开胸腔,心脏灌注预热的TBS约50ml。分离肾脏,洗涤后称重、研磨。研磨液经三次洗涤后一部分进行噬菌体滴度测定,余下的铺IPTG/X-gal平板,刮取平板上至少200个蓝色噬菌斑,感染处于对数中期的大肠杆菌ER2738,并在ER2738内进行扩增,扩增后的噬菌体同样进行滴度测定,计算下一轮循环所需要的噬菌体量。重复以上操作进行三轮循环。
2、多肽测序第三轮循环后,测定未扩增噬菌体洗液滴度,随机扩增滴度测定板上24个蓝色单克隆,分别提取其DNA。用试剂盒内的-96gIII引物在全自动测序仪上进行测序列,并分析这些多肽的共有序列。
3、免疫组化染色将出现次数最多的多肽噬菌体注入Balb/c鼠体内,循环10分钟后心脏灌注,收获其肾脏,制成新鲜的冰冻切片,先后与抗M13单克隆抗体和辣根过氧化物酶连接的兔抗小鼠单克隆抗体进行孵育,最后加底物DAB显色,以小鼠脑,心脏,肺,肝作为对照。
结果:经过三轮筛选,特异性结合于小鼠肾脏血管的噬菌体得到富集,测序结果显示多肽序列VSASYHR出现的概率最大(62.5%),其次为GQWGARG(25%)。免疫组化染色显示以上两种多肽噬菌体均富集于小鼠肾脏,与肾脏血管内皮特异性结合。
结论:利用噬菌体七肽文库C7C对小鼠进行体内筛选,可以得到小鼠肾脏血管特异性多肽,为肾脏的靶向诊断和治疗提供新的思路。