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新生儿急性肾损伤是NICU的常见疾病之一。虽然关于新生儿肾损伤的研究还相对较少,但是新生儿急性肾损伤却很常见。且由急性肾损伤造成的死亡也很常见,晚期极易造成肾功能不全,在极低体重新生儿以及合并其它疾病者更甚。近年来,对新生儿急性肾损伤的研究日渐增多。新生儿的血流动力学最突出的特点是血容量低下,肾脏的灌注量也低。因此,在休克、感染、低体温等各种病理状态下,新生儿的肾功能更易遭到损害,引起新生儿肾损伤。由内毒素所致的急性肾功能衰竭的死亡率约占70%。目前,关于内毒素性急性肾功能衰竭的病理机制还不明确。脂多糖(LPS)作为内毒素,广泛应用于动物内毒素性脏器损伤模型的制备过程中。内毒素性肾损伤时肾脏的血流动力学发生改变,微循环障碍,使机体呈现缺血缺氧状态;且内毒素性肾损伤时,肾脏谷氨酰胺的耗竭加速,肾小管上皮细胞的氧化代谢也发生障碍。有研究表明缺氧诱导因子HIF-1α,作为低氧时发挥作用的调控基因,可在缺氧条件下产生核蛋白,与其靶基因结合,使机体对缺氧环境产生适应性改变,且内毒素性肾损伤时HIF-1α过表达。HIF-1α可通过NF-κB途径促发炎性因子的释放,加重肾脏的损害;另有研究表明,谷氨酰胺Gln作为肾脏糖异生的底物,以及肾小管细胞氧化代谢的燃料,在内毒素血症发生时可以抑制肾小管上皮细胞的凋亡,且可以减缓线粒体呼吸功能受抑制程度。盐酸戊乙奎醚(PHC)是一种广泛应用于临床麻醉中的新型抗胆碱药。很多研究表明,其在改善休克患者的微循环、减轻内脏多器官的损伤方面发挥着重要作用,可视为纠正内毒素性休克时微循环痉挛理想的血管活性药物。且在以往的研究中发现,盐酸戊乙奎醚可通过调节HIF-1α和Gln的表达来降低内毒素性肠损伤,且我们通过大量的临床案例观察到盐酸戊乙奎醚的应用可以明显改善内毒素性急性肾损伤时肾脏的功能。因此,本研究制备的模型为LPS致新生7日龄大鼠急性内毒素性肾损伤,探讨预先使用抗胆碱药盐酸戊乙奎醚对肾组织HIF-1α和Gln表达的影响,进一步探讨其具体作用机制。目的观察新生大鼠内毒素性急性肾损伤时肾组织中HIF-1α以及Gln的表达;以盐酸戊乙奎醚预先给药为干预手段,观察其对新生大鼠内毒素性肾损伤时HIF-1α以及Gln的表达的影响;探讨盐酸戊乙奎醚预先给药对内毒素性肾损伤时实现肾脏保护作用的具体机制,以期找到新的治疗途径来面对新生儿内毒素性肾损伤。材料与方法1实验对象SD大鼠72只(1周龄,SPF级,健康);购于河南省实验动物中心(郑州大学),不限雌雄,体重15.0~18.0g。2实验方法2.1实验对象分组依据研究内容,将实验动物随机分为两部分:48只和24只。第一部分:取48只,根据随机数字表法将其分为3组,每组16只(n=16)。分别为C组:对照组(PBS液);K组:LPS肾损伤组和P组:PHC组。此部分实验动物于造模后观察其行为学方面及精神状态的变化,并计算各组造模后24h时的死亡率。第二部分:随机将剩余的24只新生鼠分为C组、K组和P组,每组8只。此部分实验用于观察三组间肾组织HIF-1α和Gln以及相关因子的表达、肾组织湿/干重比的测定以及光镜下观察肾组织病理形态学改变。2.2动物模型的制备两部分实验动物同时制模。C组:腹腔注射PBS液10ml/kg;P组:腹腔PHC 2mg/kg注射,将浓度稀释至0.10mg/ml;K组:腹腔LPS 5mg/kg注射,将浓度稀释至1.0mg/ml。给药方式:P组和K组均注射LPS,P组LPS注射前30min注射PHC。腹腔注射部位要求一致,回抽无血无气体。实验动物于制模后标记清楚,放回鼠笼与母鼠共同喂养,保持喂养环境的稳定。第二部分老鼠于造模后6小时时麻醉,取材,冻存,备用。2.3肾组织的标本采集腹腔注射3ml/kg的10%水合氯醛进行麻醉,麻醉后接小动物呼吸机,将老鼠以背卧位固定于手术台上。从胸部正中剪开2.0~2.5cm,暴露肋骨和肌肉,触摸到心尖的搏动后,使用注射器(5号针头)进行心脏采血。将血标本于室温下(22℃~25℃)静置1小时,1200r/min离心10分钟,取上清液,-80℃冰箱中保存待检。开腹后取下左右两肾。右肾上二分之一,匀浆处理,用于HIF-1α、Gln等指标的检测;右肾下二分之一,使用Trizol法提取RNA,RT-PCR法检测HIF-1αm RNA的表达;左肾上二分之一用于肾湿/干重比的检测;左肾下二分之一,HE染色后,观察其病理学改变。2.4检测指标2.4.1计算肾组织湿/干重比(W/D)使用滤纸吸取多余水分后,电子天平称量左肾上二分之一,并记录湿重。继而放入70℃恒温烘干箱48小时,行称量,记录干重,计算湿/干重比。2.4.2肾组织形态学观察将左肾下二分之一组织放入10%多聚甲醛(多聚甲醛体积大于肾组织体积的3倍)中48小时使其固定充分。石蜡包埋,HE染色。400倍光镜下观察肾的组织结构病理学改变。2.4.3 ELISA法测定肾组织中TNF-α、IL-6、HIF-1α、Gln的含量对右肾上二分之一肾组织进行称重,取缓冲液PBS,以1/9容量比配置,使用匀浆器制备组织匀浆。3500r/min离心10分钟,取上清,于-80℃冰箱中保存待使用。严格按照ELISA试剂盒(R&D公司,美国)的使用说明书检测TNF-α、IL-6、HIF-1α、Gln的表达。2.4.4 RT-PCR法测定肾组织HIF-1αm RNA的表达将右肾下二分之一组织经DEPC水冲洗后滤纸吸干,于液氮中速冻后,随后置入-80℃冰箱保存待检。使用Trizol法提取肾脏的RNA,HIF-1αm RNA在新生鼠肾组织的表达经步骤:反转录、DNA扩增、糖琼脂糖凝胶电泳等检测。3统计学方法处理采用SPSS17.0统计学软件包进行统计学分析,以均数±标准差(x±s)表示计量资料,多组间比较单因素方差分析,两两之间相比较采用最小显著差异法(LSD-t),设定检验水准为α=0.05,即P值当小于检验水准时,差异有统计学意义。结果1.生存状态观察腹腔注射LPS后,1小时后K组新生鼠开始颤抖,呼吸频率增快。于3小时后全身颜色呈现灰白色,活动迟缓,体温明显降低。6小时后皮肤颜色较3小时时更甚,不活动也不进食,口唇青紫,呈现严重缺氧状态。同时期P组新生鼠症状较K组状态有明显改善。C组新生鼠活动、进食及精神状态等情况皆正常。C组、P组及K组的24h死亡率分别为0%、12.4%和50%。2.肾组织的湿/干重比的结果:P组和K组较之于C组均有明显升高(P<0.05);P组较之于K组,显著降低(P<0.05);各组间比较差异均有统计学意义。3.肾组织病理学结果显示:C组肾组织形态学无明显改变,基本正常。K组肾小管上皮细胞明显肿胀,管腔变窄,充血,水肿,部分肾小管上皮细胞空泡化变形或者透明样变性。管腔内可见大量的脱落细胞、红细胞和细胞管型,间质血管扩张充血,且大量炎性细胞浸润。与K组比较,P组肾小管上皮细胞肿胀明显减轻,间质少许充血以及炎性细胞浸润,病理改变有明显改善。4.P组和K组肾组织中的HIF-1α、IL-6、TNF-α含量较之于C组均有显著增加(P<0.05),Gln含量显著降低(P<0.05),差异有统计学意义;较之于K组,P组肾组织中IL-6、TNF-α、HIF-1α含量均较低,Gln的含量较高(P<0.05),差异有统计学意义。5.HIF-1αm RNA在肾组织中的表达结果:K组和P组较之于C组,均明显增加(P<0.05);P组较之于与K组,明显降低(P<0.05);差异均有统计学意义。结论盐酸戊乙奎醚预先给药能够减轻内毒素血症时肾组织炎症反应,改善其组织病理学变化。对内毒素性肾损伤发挥肾保护作用的机制:可能是通过抑制HIF-1α在肾组织中的表达;也可能通过保护内毒素损伤情况下肾脏谷氨酰胺代谢途径,减少谷氨酰胺的消耗有关。