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目的:为提高exosomes的免疫原性,制备白细胞介素-2(interleukin-2, IL-2)锚定的膀胱移行细胞癌(transitional cell carcinoma of bladder, TCCB)T24细胞来源的exosomes(Ex/GPI-IL-2)疫苗,研究其电镜形态、免疫分子组成及体外诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)杀伤T24细胞的效应,为膀胱移行细胞癌的免疫治疗提供理论基础。方法:1.通过基因合成技术将糖基化磷脂酰肌醇(GPI)信号肽序列与人IL-2基因拼接成融合基因,构建pEGFP-N1-IL2gpi质粒。膀胱移行细胞癌T24细胞经质粒转染和G418筛选后,分别建立稳定表达GPI-IL-2融合蛋白和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的细胞系T24/GPI-IL-2和T24/p,通过免疫荧光显微技术和ELISA检测IL-2锚定蛋白的表达;2.收集T24/GPI-IL-2、T24/p和T24 48h细胞培养液,采用超速和蔗糖梯度密度离心法提取exosomes(Ex/GPI-IL-2、Ex/p和Ex),用电镜负染技术进行形态观察,Western blot和ELISA方法进行分子标志检测;3采用密度梯度离心法从正常人外周血分离单个核细胞,利用重组人粒细胞集落刺激因子(recombinant humangranulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)和重组人白细胞介素-4(recombinant human interleukin-4, IL-4)细胞因子联合培养,诱导树突状细胞形成,倒置显微镜和扫描电镜观察其形态。从外周血中分离T淋巴细胞,通过混合淋巴细胞反应检测负载Ex/GPI-IL-2的DCs诱导的T淋巴细胞的增值效应,通过细胞毒实验检测负载Ex/GPI-IL-2的DCs诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)对膀胱癌细胞T24、BIU-87和肾癌细胞RC-2的杀伤效应。结果:1.成功构建重组质粒pEGFP-N1-IL2gpi,经过酶切和DNA测序鉴定与预期结果一致,经过转染和筛选后的细胞系稳定表达GPI-IL-2蛋白和绿色荧光蛋白;2.通过超速和蔗糖梯度密度离心法,分别从T24/GPI-IL-2、T24/p和T24细胞培养液中成功的提取了Ex/GPI-IL-2、Ex/p和Ex,均为直径约30～90nm的类圆碟形小囊泡,均表达细胞间粘附分子(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)、热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)和黑色素瘤相关抗原A1(melanoma antigen family A member-1,MAGE-1)等,三种蛋白表达量没有明显的差异,通过ELISA检测到基因GPI-IL-2修饰的T24细胞来源的exosomes表达锚定状态的IL-2;3.外周血单个核细胞中的贴壁细胞在细胞因子GM-CSF和IL-4的作用下,诱导出具有典型树枝状突起的DCs细胞。Ex/GPI-IL-2、Ex/p和Ex经过DCs细胞负载后,诱导T细胞的增值指数分别为2.78±0.25,1.94±0.32和1.92±0.28,分别活化的CTL在效靶比为50:1时,对T24细胞的杀伤率分别为:53.01±2.25%,37.22±2.49%和37.85±1.57%,相应的CTL释放的IFN-γ分别为:1054.82±35.20pg/ml,678.02±17.97pg/ml和683.23±13.99 pg/ml,Ex/GPI-IL-2活化的CTL对膀胱癌细胞T24、BIU-87和肾癌细胞RC-2的杀伤率分别为:53.01±2.25%,46.61±2.60%和31.38±2.33%。结论:膀胱移行细胞癌T24可以向细胞外释放exosomes,含有肿瘤抗原MAGE-1和免疫相关蛋白HSP70、ICAM-1等;通过基因转染技术,可以将IL-2锚定到T24细胞来源的exosomes上,获得的Ex/GPI-IL-2具有更强的对T24细胞的诱导杀伤效应,并且有一定的交叉抗肿瘤作用,为以exosomes为基础的肿瘤免疫治疗提供了新的途径。