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葡萄糖二酸是一种高附加值天然有机酸,主要应用于材料与保健食品等领域。随着代谢工程和合成生物学的发展,葡萄糖二酸人工合成途径已在大肠杆菌（Escherichia coli）、毕赤酵母（Pichia pastoris）中成功构建。肌醇通过肌醇加氧酶（MIOX）和醛酸脱氢酶（Udh）的催化生成葡萄糖二酸。在葡萄糖二酸合成途径中,MIOX是关键的限速酶。本文通过构建葡萄糖二酸指示系统,筛选催化效率提高的MIOX突变体;借助双亲短肽融合策略,进一步提高MIOX的稳定性;在此基础上,通过强化肌醇的合成与优化培养条件,提高葡萄糖二酸的产量。本研究的主要结论如下:（1）葡萄糖二酸指示系统的构建与MIOX突变体的筛选。基于整合绿色荧光蛋白与受葡萄糖二酸变构调控的蛋白CdaR,成功构建了葡萄糖二酸的指示系统,通过绿色荧光蛋白的荧光强度来反映葡萄糖二酸的浓度。研究表明该葡萄糖二酸指示系统在葡萄糖二酸浓度在0-600 mg·L-1范围内具有很好的线性关系。采用易错PCR策略,构建了MIOX突变体库,并借助基于大肠杆菌的葡萄糖二酸指示系统,成功筛选到3个MIOX正向突变体K59V/R60A、R171S和D276A。（2）MIOX与Udh的表达优化与葡萄糖二酸合成的强化。通过分别比较不同的融合蛋白连接肽以及不同类型启动子,发现使用S1v1连接肽将Udh融合于MIOX的N端有助于提高MIOX的稳定性,最终确定采用组成型启动子GAP以及S1v1连接肽用于Udh和MIOX的融合表达。（3）肌醇合成途径的强化。过表达肌醇合成途径的hxk基因（编码葡萄糖激酶HXK）、Ino1基因（编码肌醇-1-磷酸合成酶INO1）、Inm1基因（编码肌醇单磷酸酶INM1）,强化肌醇的积累量从而提高葡萄糖二酸的产量。通过共表达hxk、Ino1和Inm1,葡萄糖二酸积累由331.9±12.3 mg·L-1提高至435.7±7.0 mg·L-1。（4）重组高产菌P.pastoris GS115-UsvM（R171S）-HNM的培养基组分及培养条件的优化。通过对重组菌株摇瓶水平发酵条件优化,确定最佳培养基组分:酵母粉10 g·L-1,葡萄糖60 g·L-1,甘油20 g·L-1,Fe2+0.5 mmol·L-1,并去除培养基中的Cu2+;确定最佳培养条件:500 mL摇瓶中装液量为100 mL,培养温度34℃,pH为6.0。经培养基组分及培养条件优化后,重组菌株的葡萄糖二酸产量达到1189.9±154.1 mg·L-1,相比优化前的产量766.3±94.3 mg·L-1,提高55%。参考摇瓶水平重组菌株的培养基组分及培养条件,进行放大实验,在3-L发酵罐水平培养96 h后,葡萄糖二酸的产量达到8.47 g·L-1。