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目的:研究铁过载(IO)对中高危骨髓增生异常综合征(MDS)患者骨髓间充质干细胞(BM-MSC)数量、功能的影响及其损伤的相关机制,并揭示铁过载在促进MDS转白中的作用;研究砷剂联合地西他滨协同抗MDS细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用,揭示两药协同诱导MDS细胞凋亡相关机制,为两药协同治疗MDS患者提供依据。内容:选取中高危MDS患者40例(IO MDS组18例:铁蛋白≥1000ng/ml;NIO MDS组22例:铁蛋白<1000ng/ml),铁过载MDS/AML患者10例及健康对照19名。体外培养诱导BM-MSC,检测IO对中高危MDS患者BM-MSC数量及功能的影响,同时检测IO对BM-MSC内活性氧自由基(ROS)水平、凋亡率及其相关信号通路的影响,检测抗氧化或去铁处理对IO MDS组BM-MSC的影响。进一步探究铁过载促进MDS转白的相关机制。选取MDS细胞株体外培养,检测砷剂联合地西他滨对MDS细胞增殖及凋亡的影响,探究内质网应激相关信号通路在两药协同抗MDS细胞中的作用。方法:第一部分铁过载损伤中高危MDS患者BM-MSC及促进转白的机制研究。抽取无菌骨髓分离骨髓单个核细胞,体外培养诱导BM-MSC,观察形态及数量,流式细胞术(FCM)检测BM-MSC表面分子标记。采用CCK-8方法检测BM-MSC增殖水平。体外诱导BM-MSC成骨分化并染色鉴定。采用RT-PCR方法检测BM-MSC内调控造血相关基因表达水平,应用Elisa方法检测其培养上清TGF-β1浓度。采用FCM检测BM-MSC内ROS水平及凋亡率。采用RT-PCR及Western blot方法检测BM-MSC内增殖、凋亡及Wnt/β-catenin相关信号分子表达水平。给予IO MDS组BM-MSC抗氧化及去铁处理,检测上述指标变化。检测IO对中高危MDS患者基因突变的影响,并比较IO MDS组与IO MDS/AML组BM-MSC在ROS水平、凋亡率、上述基因及蛋白表达水平的差异。第二部分砷剂联合地西他滨协同抗MDS细胞的机制研究。给予砷剂、地西他滨及两药联合作用于MUTZ-1及SKM-1细胞株72h,采用CCK-8方法测定两药作用于MDS细胞的IC50值,计算两药联合指数(CI),采用FCM检测细胞凋亡率。采用RNA-sequence方法检测单药及两药联合作用于MUTZ-1细胞内基因差异;采用RT-PCR及Western blot方法检测单药及两药联合作用于MDS细胞内质网应激相关基因及蛋白表达水平;采用FCM方法检测细胞ROS水平。采用FCM检测抗氧化处理对两药联合作用于MDS细胞内ROS水平及凋亡率的影响。采用RT-PCR方法检测抗氧化处理对两药联合作用于MDS细胞内质网应激相关基因表达水平的影响。结果:第一部分铁过载损伤中高危MDS患者BM-MSC及促进转白的机制研究1、IO MDS组BM-MSC较NIO MDS组BM-MSC数量减少,形态未见明显差异,纯度达90%以上,铁颗粒沉积量明显增多,成骨分化能力明显下降。IO MDS组及NIO MDS组BM-MSC增殖能力均较对照组明显下降,且在增殖第6、8、10天,IO MDS组BM-MSC均较NIO MDS组增殖能力明显下降。IO MDS组BM-MSC内VEGFA基因相对表达量(0.39±0.46)较NIO MDS组(0.81±0.66)及对照组(1.21±0.69)明显下降(p<0.05);IO MDS组BM-MSC内CXCL12基因相对表达量(0.59±0.66)较NIO MDS组(1.11±0.83)及对照组(1.20±0.88)明显下降(p<0.05)。IO MDS组BM-MSC内TGF-β1基因相对表达量(0.52±0.45)较NIO MDS组(1.02±0.71)及对照组(1.16±0.73)均明显下降(p<0.05);IO MDS组BM-MSC培养上清TGF-β1浓度(1871.79±601.87)pg/ml明显低于NIO MDS组(2610.59±464.51)pg/ml及对照组(3323.03±724.18)pg/ml(p<0.05)。2、IO MDS组BM-MSC内ROS水平(1188503.71±151641.12)较NIO MDS组(1031773.06±125481.41)与对照组(911600.09±134124.83)明显升高(p<0.05)。IO MDS组BM-MSC总凋亡率(47.49±11.38)%较NIO MDS组(38.16±6.86)%与对照组(30.24±8.51)%均明显升高(p<0.01)。IO MDS组BM-MSC内caspase3基因相对表达量(1.99±1.07)明显高于NIO MDS组(1.44±0.74)与对照组(1.13±0.59)(p<0.05);IO MDS组BM-MSC内β-catenin基因相对表达量(4.64±2.63)明显高于NIO MDS组(2.46±1.24)与对照组(1.25±0.70)(p<0.001)。IO MDS组BM-MSC内p-AKT、GSK-3β、p-GSK3β蛋白表达水平均低于NIO MDS组与对照组,而caspase3及β-catenin蛋白表达水平均高于NIO MDS组与对照组。给予IO MDS组BM-MSC药物N-乙酰半胱氨酸(NAC)及去铁胺(DFO)分别处理24h,IO MDS组BM-MSC内ROS、凋亡率、caspase3及β-catenin基因和蛋白表达水平较处理前均明显减少,而p-AKT、GSK-3β、p-GSK3β蛋白水平较处理前增加。同时IO MDS组BM-MSC内VEGFA、CXCL12及TGF-β1基因表达量均较处理前明显升高(p<0.05)。3、IO MDS组发生两种及以上基因突变频率较NIO MDS组明显增加,且IO MDS组发生TET2及ASXL1基因突变频率较NIO MDS组明显增加(p<0.05)。IO MDS/AML组BM-MSC数量较IO MDS组减少,p-AKT蛋白表达水平明显下降。IO MDS/AML组BM-MSC内ROS水平较IO MDS组明显增加(p<0.05)。然而在IO MDS/AML组与IO MDS组BM-MSC比较中,二者在凋亡率、VEGFA基因、CXCL12基因、caspase3及β-catenin基因和蛋白表达水平均无明显统计学差异(p>0.05)。第二部分砷剂联合地西他滨协同抗MDS细胞的机制研究1、单药砷剂及单药地西他滨作用于MUTZ-1细胞72h药物IC50浓度分别为0.699(0.478-1.022)μM,4.182(3.689-4.740)μM,CI<1。单药砷剂及单药地西他滨作用于SKM-1细胞72h药物IC50浓度分别为1.457(0.939-2.259)μM,1.162(0.461-1.422)μM,CI<1。砷剂联合地西他滨诱导MUTZ-1细胞凋亡率(57.75±9.87)%明显高于砷剂组(27.04±3.85)%、地西他滨组(31.89±6.00)%及对照组(7.18±1.39)%(p<0.01)。砷剂联合地西他滨诱导SKM-1细胞凋亡率(78.57±1.37)%明显高于砷剂组(49.91±4.12)%、地西他滨组(60.99±2.25)%及对照组(11.64±2.47)%(p<0.001)。2、采用RNA-sequence方法检测砷剂、地西他滨及两药联合作用于MUTZ-1细胞内基因差异,结合GSEA基因功能分析,发现内质网应激相关信号通路在两药联合诱导MUTZ-1细胞凋亡中发挥重要作用。两药联合作用于MUTZ-1细胞内DDIT3、GRP78、GADD34及caspase3基因表达量均明显高于对照组、砷剂组及地西他滨组(p<0.05)。两药联合作用于SKM-1细胞内DDIT3、ATF6、GRP78及caspase3基因表达量均明显高于对照组、砷剂组及地西他滨组(p<0.05)。砷剂联合地西他滨作用于MUTZ-1细胞内ROS水平(140620.33±8265.45)明显高于砷剂组(123138.67±5692.58)、地西他滨组(91830.33±4857.53)及对照组(105255.33±3577.11)(p<0.01)。砷剂联合地西他滨组SKM-1细胞内ROS平均荧光强度(204463.00±6750.81)明显高于砷剂组(169393.33±14367.41)、地西他滨组(147279.33±25314.92)及对照组(82094.67±11567.04)(p<0.05)。两药联合作用于MDS细胞内AKT及BCL2蛋白表达水平均较单药组及对照组降低,而CHOP、BIP、ATF6及caspase3蛋白表达水平均较单药组及对照组增加。3、抗氧化处理能明显降低砷剂联合地西他滨组MDS细胞内ROS水平,抗氧化组MUTZ-1细胞内ROS水平(118830.00±8429.79)明显低于两药联合组(140620.33±8265.45)(p<0.01);抗氧化组SKM-1细胞内ROS水平(141005.33±8671.97)明显低于两药联合组(204463.00±6750.81)(p<0.001)。同时也能明显降低两药联合组MDS细胞凋亡率,抗氧化组MUTZ-1细胞凋亡率(42.42±7.18)%明显低于两药联合组(57.75±9.87)%(p<0.05);抗氧化组SKM-1细胞凋亡率(67.90±2.31)%明显低于两药联合组(78.57±1.37)%(p<0.01)。抗氧化处理能明显降低两药联合作用于MUTZ-1细胞内DDIT3、GRP78及GADD34基因表达量(p<0.05)。抗氧化处理能明显降低两药联合作用于SKM-1细胞内ATF6、GRP78及GADD34基因表达量(p<0.05)。结论:1、铁过载能明显降低中高危MDS患者BM-MSC数量、减弱其增殖及成骨分化能力,抑制其造血调控相关基因VEGFA、CXCL12及TGF-β1表达水平。同时IO可明显增加中高危MDS患者BM-MSC内ROS水平及凋亡率,激活caspase3及β-catenin相关信号通路,而抗氧化及去铁处理均能在一定程度上逆转上述损伤。IO MDS组发生基因突变频率明显高于NIO MDS组。同时IO可进一步降低MDS/AML患者BM-MSC内p-AKT蛋白表达水平,降低其数量;然而IO并未明显增加MDS/AML患者BM-MSC凋亡率、VEGFA、CXCL12、caspase3及β-catenin等基因或蛋白表达水平。表明铁过载可影响中高危MDS患者BM-MSC数量及功能,并通过激活凋亡及Wnt/β-catenin相关信号通路损伤细胞;同时铁过载可能通过影响中高危MDS患者基因稳定性及损伤BM-MSC促进MDS转白。2、砷剂联合地西他滨发挥协同抗MDS细胞增殖及诱导细胞凋亡作用。采用RNA-sequence方法筛选出内质网应激相关信号通路在砷剂联合地西他滨诱导MUTZ-1细胞凋亡中发挥重要作用。两药联合作用于MDS细胞内质网应激相关基因及蛋白表达水平显著增加。两药联合可显著增加MDS细胞内ROS水平,给予两药联合组抗氧化处理,MDS细胞内ROS水平、凋亡率及内质网应激相关基因表达量均明显下降。表明砷剂联合地西他滨可通过内质网应激相关凋亡机制协同发挥抗MDS细胞作用。