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南极磷虾（Euphausia superba）是生活在南极水域的一种小型甲壳类动物，储量丰富，营养价值高，富含蛋白质、脂质、矿物质和虾青素等营养成分，在医药和食品领域具有很高的开发应用潜力，日益引起世界各国的广泛关注。目前南极磷虾主要用于磷虾油的生产，而其生产加工的副产物-脱脂磷虾粉则主要用于动物饲料的生产，利用价值较低。酶解蛋白副产物生产生物活性肽是提高蛋白资源附加值的重要手段，目前对脱脂南极磷虾粉的蛋白酶解利用鲜有报道。本研究采用实验室筛选的Bacillus sp.SM98011产的胞外蛋白酶BP-01对南极磷虾粉进行酶解利用，通过优化建立了酶解工艺，获得了寡肽含量丰富的酶解产物。生物学功能研究表明酶解产物具有很好的抗氧化活性、降血压活性和免疫调节活性。因此南极磷虾寡肽在医学免疫和功能性食品等领域中具有潜在的应用价值。
1.南极磷虾寡肽的酶解制备工艺优化
Bacillus sp.SM98011产的胞外蛋白酶BP-01是实验室筛选的高活性中温蛋白酶，对多种蛋白资源具有很好的水解效果。本研究在实验室前期工作的基础上，以南极磷虾粉作为酶解原料，采用单因子实验方法，研究了酶解体系中的液固比(L/S)、酶解时间(Time)和酶/底物比(E/S)对虾粉蛋白回收率的影响，优化得到BP-01酶解南极磷虾粉的酶解条件。在酶解温度为50℃、初始pH为7.5、L/S为10mL/g、Time为6.0h、E/S为4000U/g的条件下酶解效率最高，虾粉蛋白回收率达到71.69±1.72％。在此基础上，进行1L小罐的酶解实验，小罐装液量为80％，搅拌速度200rpm，在50℃条件下酶解6.0h，蛋白回收率为75.87±1.24％。氨基酸分析发现摇瓶和小罐体系酶解产物的总氨基酸含量分别达到84.16±2.30g/100g和85.34±1.81g/100g，小罐体系要稍高些，与两种条件下蛋白回收率保持一致。酶解产物肽含量丰富，分别占寡肽蛋白含量94.60±0.03％和95.34±0.02％。17种常见氨基酸中Glu含量最高，其次是Ser，人体必需氨基酸中Lys含量最高。摇瓶与小罐酶解产物以寡肽为主，肽谱高度一致，分子量低于3，000Da的产物分别为98.32％和99.16％，低于1，000Da的寡肽含量高达87.60％和91.45％，因此，蛋白酶BP-01可以高效地水解南极磷虾粉，获得寡肽含量丰富的酶解产物，体系的增大更有利于蛋白资源的酶解，这为中试和工业化酶解制备奠定了基础。
2.南极磷虾寡肽的生物学功能评价
为了更好的利用南极磷虾寡肽，本研究采用KunMing（KM）小鼠急性经口毒性实验和致突变实验对其安全性进行评价。急性经口毒性实验结果表明南极磷虾寡肽的半数致死量(LD50)大于5，000mg/kg，属于无毒级别。致突变实验表明南极磷虾寡肽没有造成微核的形成，精子形态和数量无异常，不会引起遗传物质的突变，即无致突变作用。
在此基础上，我们研究了南极磷虾寡肽的抗氧化活性、血管紧张素转化酶(Angiotensin-converting enzyme，ACE)抑制活性和免疫调节活性。
抗氧化活性分析表明，采用10.0mg/mL的作用浓度，南极磷虾寡肽对自由基DPPH·、·OH和O2-·清除率分别达到69.17±0.38％、66.62±1.51％和47.19±3.05％，对ABTS·+的清除能力与0.68±0.01mM的Trolox相当，其还原能力与0.44±0.02mM的Trolox相当，对金属离子(Fe2+)的螯合能力为36.37±2.27％。因此，南极磷虾寡肽具有很好的抗氧化活性。
体外降血压活性分析发现南极磷虾寡肽对ACE具有很高的抑制活性，当酶解产物作用浓度为2.0mg/mL时，其对ACE的抑制率达到87.64±0.74％，IC50值为0.229±0.005mg/mL，表明南极磷虾寡肽具有开发为新型降血压药物和功能性食品的潜力。
采用不同剂量[低剂量(250mg/kg)、中剂量(500mg/kg)、高剂量(1，000mg/kg)]的南极磷虾寡肽灌胃处理接种腹水瘤细胞S-180的BALB/c小鼠，研究其免疫调节活性。研究发现，不同剂量的南极磷虾寡肽处理荷瘤小鼠均能促进免疫器官的生长，中剂量组处理效果最好，胸腺指数和脾脏指数分别达到2.50±0.52mg/g和7.53±0.77mg/g，抑瘤率达到66.95％。非特异性免疫活性分析发现灌服中剂量组南极磷虾寡肽能够显著提高荷瘤小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力，吞噬率达到60.33±2.08％，高于阴性对照19％，差异极显著。体液免疫分析发现不同剂量的南极磷虾寡肽均能不同程度地促进抗体的分泌能力，中剂量组效果最好，413nm处的光吸收值为0.546±0.004，明显高于阴性对照(OD413=0.429±0.005)。通过分析南极磷虾寡肽对淋巴细胞增殖能力、NK细胞活性、CTL细胞杀伤活性及外周血清中细胞因子白细胞介素-2(IL-2)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量等的影响研究了酶解产物对机体细胞免疫的影响，发现中剂量组处理小鼠的细胞免疫能力增强显著，其淋巴细胞增殖能力显著提高，在450nm处的光吸收值为0.95±0.01，与阴性对照组差异极显著(OD450=0.54±0.01);中剂量组NK细胞活性为26.94±2.25％，CTL细胞杀伤活性为41.55±1.77％，分别高于阴性对照12.12％和37.55％，差异极显著;中剂量组外周血清中细胞因子IL-2和TNF-α含量分别为999.03±16.85ng/L和848.22±17.10ng/L，分别高于阴性对照916.25ng/L和490.89ng/L，差异显著。因此，南极磷虾寡肽能够促进免疫器官的生长，提高非特异性免疫、体液免疫和细胞免疫能力，从而增强机体免疫能力，有效地抑制肿瘤的生长，为开发新型抗肿瘤药物奠定了一定的理论基础。
以上实验结果表明，中温蛋白酶BP-01是一种能高效制备具有良好生物功能的南极磷虾寡肽的工具酶。其酶解产物安全无毒，具有很好的抗氧化活性、降血压活性和免疫调节活性，在功能性食品和医药卫生等领域具有良好的应用潜力。
1.南极磷虾寡肽的酶解制备工艺优化
Bacillus sp.SM98011产的胞外蛋白酶BP-01是实验室筛选的高活性中温蛋白酶，对多种蛋白资源具有很好的水解效果。本研究在实验室前期工作的基础上，以南极磷虾粉作为酶解原料，采用单因子实验方法，研究了酶解体系中的液固比(L/S)、酶解时间(Time)和酶/底物比(E/S)对虾粉蛋白回收率的影响，优化得到BP-01酶解南极磷虾粉的酶解条件。在酶解温度为50℃、初始pH为7.5、L/S为10mL/g、Time为6.0h、E/S为4000U/g的条件下酶解效率最高，虾粉蛋白回收率达到71.69±1.72％。在此基础上，进行1L小罐的酶解实验，小罐装液量为80％，搅拌速度200rpm，在50℃条件下酶解6.0h，蛋白回收率为75.87±1.24％。氨基酸分析发现摇瓶和小罐体系酶解产物的总氨基酸含量分别达到84.16±2.30g/100g和85.34±1.81g/100g，小罐体系要稍高些，与两种条件下蛋白回收率保持一致。酶解产物肽含量丰富，分别占寡肽蛋白含量94.60±0.03％和95.34±0.02％。17种常见氨基酸中Glu含量最高，其次是Ser，人体必需氨基酸中Lys含量最高。摇瓶与小罐酶解产物以寡肽为主，肽谱高度一致，分子量低于3，000Da的产物分别为98.32％和99.16％，低于1，000Da的寡肽含量高达87.60％和91.45％，因此，蛋白酶BP-01可以高效地水解南极磷虾粉，获得寡肽含量丰富的酶解产物，体系的增大更有利于蛋白资源的酶解，这为中试和工业化酶解制备奠定了基础。
2.南极磷虾寡肽的生物学功能评价
为了更好的利用南极磷虾寡肽，本研究采用KunMing（KM）小鼠急性经口毒性实验和致突变实验对其安全性进行评价。急性经口毒性实验结果表明南极磷虾寡肽的半数致死量(LD50)大于5，000mg/kg，属于无毒级别。致突变实验表明南极磷虾寡肽没有造成微核的形成，精子形态和数量无异常，不会引起遗传物质的突变，即无致突变作用。
在此基础上，我们研究了南极磷虾寡肽的抗氧化活性、血管紧张素转化酶(Angiotensin-converting enzyme，ACE)抑制活性和免疫调节活性。
抗氧化活性分析表明，采用10.0mg/mL的作用浓度，南极磷虾寡肽对自由基DPPH·、·OH和O2-·清除率分别达到69.17±0.38％、66.62±1.51％和47.19±3.05％，对ABTS·+的清除能力与0.68±0.01mM的Trolox相当，其还原能力与0.44±0.02mM的Trolox相当，对金属离子(Fe2+)的螯合能力为36.37±2.27％。因此，南极磷虾寡肽具有很好的抗氧化活性。
体外降血压活性分析发现南极磷虾寡肽对ACE具有很高的抑制活性，当酶解产物作用浓度为2.0mg/mL时，其对ACE的抑制率达到87.64±0.74％，IC50值为0.229±0.005mg/mL，表明南极磷虾寡肽具有开发为新型降血压药物和功能性食品的潜力。
采用不同剂量[低剂量(250mg/kg)、中剂量(500mg/kg)、高剂量(1，000mg/kg)]的南极磷虾寡肽灌胃处理接种腹水瘤细胞S-180的BALB/c小鼠，研究其免疫调节活性。研究发现，不同剂量的南极磷虾寡肽处理荷瘤小鼠均能促进免疫器官的生长，中剂量组处理效果最好，胸腺指数和脾脏指数分别达到2.50±0.52mg/g和7.53±0.77mg/g，抑瘤率达到66.95％。非特异性免疫活性分析发现灌服中剂量组南极磷虾寡肽能够显著提高荷瘤小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力，吞噬率达到60.33±2.08％，高于阴性对照19％，差异极显著。体液免疫分析发现不同剂量的南极磷虾寡肽均能不同程度地促进抗体的分泌能力，中剂量组效果最好，413nm处的光吸收值为0.546±0.004，明显高于阴性对照(OD413=0.429±0.005)。通过分析南极磷虾寡肽对淋巴细胞增殖能力、NK细胞活性、CTL细胞杀伤活性及外周血清中细胞因子白细胞介素-2(IL-2)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量等的影响研究了酶解产物对机体细胞免疫的影响，发现中剂量组处理小鼠的细胞免疫能力增强显著，其淋巴细胞增殖能力显著提高，在450nm处的光吸收值为0.95±0.01，与阴性对照组差异极显著(OD450=0.54±0.01);中剂量组NK细胞活性为26.94±2.25％，CTL细胞杀伤活性为41.55±1.77％，分别高于阴性对照12.12％和37.55％，差异极显著;中剂量组外周血清中细胞因子IL-2和TNF-α含量分别为999.03±16.85ng/L和848.22±17.10ng/L，分别高于阴性对照916.25ng/L和490.89ng/L，差异显著。因此，南极磷虾寡肽能够促进免疫器官的生长，提高非特异性免疫、体液免疫和细胞免疫能力，从而增强机体免疫能力，有效地抑制肿瘤的生长，为开发新型抗肿瘤药物奠定了一定的理论基础。
以上实验结果表明，中温蛋白酶BP-01是一种能高效制备具有良好生物功能的南极磷虾寡肽的工具酶。其酶解产物安全无毒，具有很好的抗氧化活性、降血压活性和免疫调节活性，在功能性食品和医药卫生等领域具有良好的应用潜力。