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研究背景与目的6-姜酚是生姜辣味成分姜辣素中的主要成分,具有广泛的生物活性,目前研究证明其在抗氧化和抗肿瘤方面具有很好的效果。前期对6-姜酚大鼠体内药代动力学研究表明：6-酚口服给药后在大鼠体内吸收迅速,主要分布在肝脏、胃肠道组织中,而血药浓度较低,推测其口服给药存在首过效应,而肝脏是药物代谢的主要场所,虽然目前有研究确认了6-姜酚经口服给药后在大鼠尿及粪便中的代谢产物,但6-姜酚经肝脏代谢后的情况、肝脏中药酶对其代谢影响以及其本身对肝药酶有何影响还未见报道。因此本文拟通过建立大鼠肝微粒体体外孵育体系及其在大鼠肝微粒孵育体系中的HPLC-UV检测方法,研究6-姜酚在肝微粒体中的代谢情况,考察其在体外孵育体系中的酶动力学以及选择性细胞色素P450抑制剂对其代谢的影响；通过建立LC-MS条件考察6-姜酚在大鼠肝微粒中的代谢产物及其代谢途径；通过给予大鼠灌服6-姜酚,考察6-姜酚是否对参与体内药物代谢的主要肝药酶亚型活性有影响。通过上述研究探究6-姜酚在体内的可能代谢途径,肝药酶对其代谢影响以及6-姜酚对CYP450的影响,从而提供6-姜酚代谢实验资料以及与其他药物相互作用的依据,这对临床合理用药具有十分重要的意义,也为6-姜酚的进一步研究及姜的开发利用提供了理论和实验依据。方法1.采用钙沉淀法制备大鼠肝微粒体,Lowry法和一氧化碳还原光谱示差法分别测其蛋白含量和CYP450酶含量；6-姜酚在总体积为200μL孵育体系中于37℃水浴振荡孵育30mim,反应体系包含NADPH (1mM),肝微粒体蛋白(1mg·mL-1), PBS缓冲液(0.1M, PH=7.4),反应结束后150μL乙腈终止反应,加50μL内标,12000g离心10min,取上清液20μL进样。肝微粒体样品采用KcrosmasiL C18柱(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱,以甲醇-水(65：35)为流动相,流速1mL·min-1,检测波长280nm，进样量20μL,进样时间为20min,检测温度为室温进行分析测定。2.以孵育时间、大鼠肝微粒体蛋白浓度和底物浓度为考察对象,固定其中两个孵育条件,观察第三条件对6-姜酚代谢率的影响从而优化了孵育条件；考察了辅助因子NADPH和NADH对6-姜酚代谢的影响；用底物消除法计算了6-姜酚在大鼠肝微粒中的酶促动力学参数(最大速率Vmax、米氏常数Km和清除率CLint)。3.采用CYP450酶专属性抑制剂：α-萘黄酮(CYP1A)、西米替丁(CYP2C)、奎宁(CYP2D)、噻氯匹定(CYP2B)、4-甲基吡唑(CYP2E)、酮康唑(CYP3A),各抑制剂浓度范围为0-100μmol· L-1,分别加入大鼠肝微粒体中与6-姜酚共同孵育,测定6-姜酚的消除量,以阴性样品中6-姜酚消除量的百分比定量,评价不同抑制剂对6-姜酚代谢的影响。4.6-姜酚在大鼠肝微粒体中代谢产物的鉴定采用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50mm,1.7μm)色谱柱,柱温30℃。以0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脱,洗脱程序如下：0～2min,95%A;2～12min;95%～20%A;12～16min;20%～95%A;16～18min;95%A。进样量为20μL,流速为0.2mL·min-1.模式检测为ESI正离子模式,质谱采集范围m／z：100-600。离子源参数：Capillary cone:3000V, Sample cone:30V, Source Temp:100℃,去溶剂化温度：350℃,去溶剂气(N2)体积流量：500L·h-1,雾化气(N2)体积流量：50L·h-1,二级质谱碰撞能量为20V。5.利用聚酰胺柱纯化6-姜酚；雄性SD大鼠60只按体重随机分组6组,每组10只。空白组给予蒸馏水,溶媒组给予花生油2mL·100g-1,6-姜酚高、中、低剂量组分别给予花生油助溶的6-姜酚200,100,50mg·kg-1,苯巴比妥钠组给予苯巴比妥钠注射液80mg.kg-‘。空白组、溶媒组以及6-姜酚高、中、低剂量组灌胃给药7天,苯巴比妥钠组腹腔给药5天,给药结束后制备肝微粒体。通过比较实验组与空白组的肝指数、肝微粒体蛋白浓度、CYP450酶含量、CYPb5含量以及红霉素N-脱甲基酶(Erythromycin N-demethylase, ERD)和氨基比林N-脱甲基酶(Aminopyrence N-demethylase,ADM)活性,确定6-姜酚对CYP450酶活性的影响。结果1.大鼠肝微粒蛋白浓度为20.66mg·mL-1, CYP450含量为0.64nmol·mg-1protein;所建立的HPLC-UV检测方法的回收率为100.6～104.2%,日内和日间精密度RSD为1.6-7.5%,符合生物样品测定要求；6-姜酚在1～100μg.mL-1范围内呈良好的线性关系；6-姜酚在室温以及4℃下放置48h内稳定性符合实验要求。2.6-姜酚在大鼠肝微粒体中孵育的最佳时间为10min,肝微粒体蛋白浓度为1.0mg·mL-1,底物浓度为17.0μM; NADPH和NADH合用时与单独使用NADPH相比,对6-姜酚代谢程度没有明显影响,而单独使用NADH作为辅助因子时6-姜酚未有明显代谢；6-姜酚在大鼠肝微粒体中的表观米氏常数Km和Vmax分别为5.64μmol·L-1、3.13nmol·min-1·mg-1, CLint为0.55mL·min-1·mg-1。3.α-萘黄酮、噻氯匹定、西米替丁、4-甲基吡唑抑制率小于20%,所以它们无抑制作用；奎宁抑制率为20.2%,为中度抑制作用；酮康唑抑制率为65.7%,故为强抑制剂。这表明在大鼠肝微粒体中参与6-姜酚代谢的CYP450酶亚型主要是CYP3A,其次是CYP2D,而CYP1A、2B、2C、2E作用不明显。4.在大鼠肝微粒体孵育液发现了6-姜酚原型药(MO)以及2个可能代谢产物(M1、M2),经分析发现M1、M2分别为6-姜酚脱水生成的6-姜稀酚以及氧化脱氢产生的脱氢姜酮。5.通过聚酰胺柱纯化后6-姜酚的纯度大于90%；6-姜酚经口服给药后与空白组比较发现：低、中、高剂量组对肝指数、微粒体蛋白浓度没有影响(P＞0.05)；能显著降低CYP450酶以及CYPb5含量(P<0.01)；低、中、高剂量组均能抑制ADM酶的活性(P<0.01),高剂量组能抑制ERD酶的活性(P<0.01)。结论1.所建立的6-姜酚在大鼠肝微粒体中的HPLC-UV测定法方便快捷,其检测范围、回收率、精密度和稳定性基本符合生物样品分析的要求,可应用于6-姜酚在大鼠肝微粒中的代谢研究,也为6-姜酚在其他生物基质样品的测定提供了参考依据。2.6-姜酚在大鼠肝微粒体中的代谢是依赖NADPH进行的；与传统的产物生成法相比较,在选择合适的底物浓度及数据处理方法下,底物消除法是一种可靠、简便测定肝微粒体酶动力学参数的方法,所得到的酶动力学参数为6-姜酚进一步研究提供了重要参数。3. CYP3A是在大鼠肝微粒体中参与6-姜酚代谢的主要CYP450酶亚型,CYP2D次之,CYPIA、CYP2B、CYP2E、CYP2C没有参与其代谢。4.6-姜酚在大鼠肝微粒体中可能代谢产物为6-姜稀酚和脱氢姜酮,代谢途径为脱水与氧化脱氢。5.6-姜酚高、中、低剂量均能降低CYP450总蛋白和CYPb5含量,表明6-姜酚能抑制CYP450酶活性,对CYP450主要酶亚型影响上,6-姜酚高、中、低剂量能抑制ADM酶的活性；6-姜酚高剂量能抑制ERD酶的活性。这预示着6-姜酚或姜制品在临床上与其他药物特别是经CYP3A与CYP2E1代谢的药物合用时,要注意在长期大剂量使用下,可能影响这些药物的代谢。