论文部分内容阅读
X染色体的活性状态与雌性胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES cells)或诱导多能细胞(iuduced pluripotent stem cells, iPS cells)的多能状态有重要的相关性。双活性X染色体是雌性ES或iPS细胞具有生殖系嵌合能力的一种重要标志。兔是一种常用的实验室动物,虽然已经有较多的兔ES和iPS细胞系建立,但是一直未获得具有生殖系嵌合能力的细胞系,制约了转基因兔和兔胚胎发育等相关研究的进展。至今为止,在兔ES和iPS细胞的研究中,未见有关于X染色体活性状态的报道。本课题以B28-6、NJ12、NJ10等3株兔雌性ES细胞为研究对象,对兔雌性ES细胞X染色体活性状态进行研究。在前期研究中发现,兔雌性ES细胞系与人ES细胞类似,X染色体活性状态存在不同类别。3株兔雌性ES细胞在早期传代的条件下(P<10)均已经启动X染色体失活(Xchromosome inactive, XCI)。其中B28-6、NJ12免疫荧光染色H3K27me3点状着色,Xist正常表达,表现为一条活性一条失活的X染色体(XiXistXa)。有趣的是,余下的一株NJ10细胞系,H3K27me3点状着色,表明已经启动XCI,但是未检测到Xist表达(Xiw/oXistXa)。随着传代次数的增加,P12以后,丢失了H3K27me3修饰,表现为XCI受损(XeXa)。SCID小鼠体内分化试验及qRT-PCR检测结果提示,NJ10细胞存在体内分化能力缺陷及癌基因高表达。参考人ES细胞X染色体活性状态的分类,把B28-6、NJ12归为Ⅱ类,NJ10归为Ⅲ类ES细胞。在进一步试验中,证明了慢病毒介导过表达Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc等4个转录因子,联合应用N2B27+LIF+2i培养体系,可以重编程NJ10细胞系。获得类似于小鼠ES细胞一样凸起克隆样生长的细胞,称为mESC-like兔ES细胞(mouse ES cell-like rabbit ES cells)。mESC-like兔ES细胞克隆形态凸起,细胞倍增时间缩短,胰酶单细胞消化传代克隆形成率高,自我更新信号通路由bFGF转化为LIF,NJ10Ⅲ类兔ES细胞类似于人ES细胞,而mESC-like兔ES细胞类似于小鼠ES细胞。最重要的是,通过X染色体活性的相关检测,SCID小鼠皮下注射体内分化能力检测,及qRT-PCR癌基因表达检测,证明了重编程不仅可以重新激活失活的X染色体,而且mESC-like兔ES细胞体内分化能力提高,癌基因表达下降。本研究不仅证明了兔ES细胞存在多种X染色体活性状态,且与人ES细胞在X染色体活性状态上存在着保守性。也证明通过慢病毒介导过表达Oct4等转录因子,可挽救兔ES细胞存在的体内分化缺陷。这些发现为以后优化兔ES细胞的培养体系,建立具有生殖系传递能力的兔ES细胞系提供了理论依据。