[研究背景和目的]肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一大部分病人确诊时已属晚期,预后很差,肝癌5年生存率仍低于5%。HCC易侵犯门静脉形成门静脉癌栓(Portal vein tumor thrombus, PVTT),发生率约为30%-60%,更有研究者发现镜下PVTT发生率高达90%。HCC一旦侵犯门静脉并形成门静脉癌栓,预后恶劣,患者的中位生存率仅为2.7个月。PVTT不仅可以促进肝癌血行播散,而形成肝内外转移灶,而且还可进一步增加门静脉的压力,导致上消化道出血、腹水形成,加速患者临床病期进展。但是,目前对PVTT的形成机制尚不清楚,更缺乏早期防治的方法。Trousseau发现肿瘤与患者血栓形成有关,称为"Trousseau综合征”。研究表明组织因子与肿瘤患者血栓形成有关。组织因子(tissue factor, TF)又称凝血因子Ⅲ或组织凝血活酶,是凝血因子中唯一表达于细胞膜表面的Ⅰ型跨膜单链糖蛋白,是外源性凝血途径的启动因子。研究表明,TF高表达于乳腺癌、肺癌和结直肠癌等多种实体瘤组织中,能够抑制肿瘤细胞分化、促进癌栓形成以及肿瘤的远处转移,并且与患者的预后有关。更有研究提示,TF是促进循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)形成的一个重要因素,并可以作为CTCs的一个表面标志,肿瘤组织中的TF表达与其血液中CTCs的数目呈正相关性。因此,本研究旨在研究TF(+)CTCs是否与PVTT形成有关,可否作为患者预后因素以及通过体外凝血实验初步探讨TF促进PVTT形成的机制。希望为靶向TF/CTCs的肿瘤治疗提供新的理论依据和研究方向。[方法]第一部分1.免疫组化检测肝癌组织TF表达情况免疫组织化学方法检测128例肝癌患者原发灶、PVTT病理切片及30例肝血管瘤患者肝组织中TF的表达情况。2.多色免疫荧光鉴定CTCs的TF表型;进行TF分组及其与与临床数据相关性分析(1)用EDTA抗凝管抽取128例肝癌自愿者患者外周静脉中段血5m1。应用Ficoll离心+CD45免疫磁珠负分选后获得CTCs。(2)将CTCs涂片后用TF, CD45, CK抗体孵育后行多色免疫荧光染色,并在荧光显微镜下观察计数CTCs以及TF表型差异。(3)运用X-tile软件对CTCs进行分组。(4)运用SPSS软件(spearman相关)分析TF在肝癌组织和CTCs之间的表达有无一致性(5)卡方检验和Fisher精确检验统计分析TF分组与性别、年龄、乙肝表面抗原、AFP表达、包膜、肿瘤大小、病理分级、门静脉癌栓之间的关系。3. PVTT中TF表达情况(1)免疫组织化学检测肝癌患者PVTT中TF的表达情况。(2)用SPSS软件分析TF (+) CTCs与TF在PVTT中表达有无关系。4.肝癌患者的预后因素分析用SPSS软件分析TF (+) CTCs与肝癌的预后是否有联系。第二部分1.肝癌细胞系中各种肝癌细胞上TF表达率培养Hep3B、HepG2、MHCC97L、MHCC97H、 PLC/PRF/5、SMMC7721等6种肝癌细胞系,用流式细胞技术检测以上肝癌细胞TF的表达差异。2.肝癌细胞体外促凝活性实验以及TF在CTM中的表达(1)将以上TF表达最高、最低的肝癌细胞分别计数,分别取104个肝癌细胞加入到不含血小板血浆中,再加入Ca2+,用“挑丝法”检测其体外促凝活性差异。(2)用多色免疫荧光方法检测患者血液中CTM (Circulating tumor microemboli, CTM).[结果]第一部分1.免疫组化检测肝癌组织TF表达情况在128例肝癌组织中TF阳性率为69.53%,肝血管瘤患者正常肝组织中TF阳性率为6.67%。两组间存在差异,差异有统计学意义(P<0.05)。2.多色免疫荧光鉴定CTCs的TF表型；进行TF分组及其与临床数据相关性分析(1)TF阳性染色为绿色,定位于细胞膜,DAPI阳性染色为蓝色,定位于细胞核,CD45阳性染色为橙色,定位于细胞膜,CK阳性染色为红色,定位于细胞膜。(2)肝癌患者外周静脉血5ml中,CTCs检出量为5-112个之间,均值为39.95±19.61个,其中TF (+) CTCs检出量为0-103个之间,均值为20.52±16.79个,阳性率为0.00-91.96%,平均为48.59±24.41%。(3)运用X-tile软件求得,以CTCs个数12为界时两组预后差别最大。(4)TF的表达与肿瘤分化程度、血浆AFP、包膜等无明显的相关性；TF分组与原发灶肿瘤大小相关(P=0.014)、与Edmondson-steiner grade分级相关(P=0.000)、与PVTT相关(P=0.014)。(5)TF在肝癌组织和CTCs之间的表达一致。3. PVTT中TF表达情况(1)TF在PVTT中表达率为91.18%。(2)TF分组与PVTT形成相关。4. TF (+) CTCs对肝癌的预后因素分析运用SPSS18.0单因素预后分析得到,影响肝癌患者的预后因素有：TF免疫组化染色阳性率、TF (+) CTCs、CTCs和PVTT是肝癌患者的预后因素；多因素预后分析示：TF (+) CTCs和CTCs是肝癌患者的独立预后因素。第二部分1.肝癌细胞系中各种肝癌细胞上TF表达率流式细胞技术结果(图2-2)。其中Hep3B和SMMC7721细胞TF表达率较高,分别为89.16±6.21%和83.73±8.15%,而PLC/PRF/5、MHCC97H、MHCC97L和HepG2中表达表达相对较低,分别为46.96±18.14%、67.83±18.58%、59.63±10.16%、41.76±6.21%(P<0.05)。2.肝癌细胞体外促凝活性实验以及TF在CTM中的表达(1)通过与未掺肝癌细胞的正常人血浆比较,Hep3B、HepG2肝癌细胞的促凝时间相比较,发现TF高表达的Hep3B细胞凝血时间比TF低表达的HepG2时间短,两组间的差异有统计学意义。HepG2与正常人之间的凝血时间的差异无统计学意义。(2)从128例患者中仅有2例分离的到CTM。[结论]TF (+) CTCs与肝癌PVTT形成相关。TF (+) CTCs是肝癌患者的独立预后因素。TF通过促进循环肝癌细胞局部高凝促进PVTT的形成。