血瘀证作为一种基本证候,存在于临床多种疾病的发生、发展过程中。从现代医学角度来看,一些临床常见的疾病,如高血压、动脉粥样硬化、糖尿病和肿瘤等均存在血小板活化、血管内皮功能障碍、炎症与氧化应激等血瘀相关现象。　　 一氧化氮具有广泛的生理和病理效应。在血管内皮细胞和血小板中维持生理浓度的一氧化氮合成有助于调节血管张力、抑制血小板活化;超氧阴离子与一氧化氮结合会降低一氧化氮的生物利用度,促进血小板活化和内皮功能障碍;过量表达的一氧化氮主要发挥细胞毒性和蛋白质修饰作用,能引起相关炎症通路的活化,进而促进血小板聚集。因此维系生理浓度一氧化氮的良性调节作用,抑制过量一氧化氮对机体的损伤,对维持血管内环境平衡具有非常重要的意义。　　 目前阿司匹林仍是国际上最常用的抗血小板药物。2010年美国心脏病协会通过循证医学数据证明,作用于一氧化氮通路的磷酸二酯酶抑制剂与阿司匹林相比更具优势,对二次中风的预防更安全、更有效。　　 目的:　　 本研究以阿司匹林为阳性对照药,对本中心中药提取物标准库中具有抗炎或舒张血管作用的38种中药提取物进行了抗血小板聚集筛选;针对中药多层次、多靶点的作用特点,进一步考察了4种有效提取物对血小板活化、血管舒张、炎症和抗氧化等方面的作用;最终系统探讨了藤梨根提取物对血小板一氧化氮通路相关靶点的调节作用。　　 方法：　　 1.以二磷酸腺苷(ADP)、胶原和花生四烯酸为诱导剂,用Born比浊法检测38种中药提取物或单体对大鼠体外血小板聚集的影响。　　 2.根据初筛结果,对部分有效提取物的作用环节进行了深入探讨:利用微孔板比色法检测了有效提取物对血小板粘附的影响;通过透射电镜观察了血小板超微结构的变化;同时考察了药物对凝血酶、血小板活化因子诱导的兔体外血小板聚集的影响。检测了不同提取物对内皮完整或去除内皮后离体血管张力变化的影响。以LPS和INF-γ联合刺激巨噬细胞后引起iNOS活化,产生过量一氧化氮,检测药物处理后细胞培养上清液中亚硝酸盐含量的变化;采用FRAP法检测了中药提取物的直接抗氧化能力。　　 3.以藤梨根提取物良好的调节血管张力和抗血小板聚集作用为基础,通过Westernblot、放射免疫法检测了蛋白磷酸化和环核苷酸水平,探讨了藤梨根提取物对血小板内一氧化氮通路相关靶点的影响。　　 结果：　　 1.初筛结果显示,16种中药提取物或单体对ADP、花生四烯酸或胶原诱导的大鼠体外血小板聚集有不同程度的抑制作用,与对照组比较有统计学差异(P＜0.05或0.01)。　　 2.藤梨根提取物(TSRA)可以浓度依赖性抑制凝血酶诱导的兔洗涤血小板聚集(P＜0.05)和血小板粘附;对活化血小板超微结构的影响主要表现为维持细胞膜稳定,减少血小板内颗粒释放(P＜0.01);藤梨根提取物对离体主动脉环具有浓度依赖性舒张作用,该作用可以被L-NAME和ODQ阻断(P＜0.05或0.01);藤梨根提取物还具有良好的直接抗氧化能力,对巨噬细胞活化后过量NO产生无抑制作用。　　 藤梨根的主要化学成分包括熊果酸、大黄素和大黄素甲醚等。本研究检测了这三种单体成分对血小板聚集、粘附和超微结构的影响。结果显示,大黄素和大黄素甲醚可显著抑制ADP诱导的大鼠体外血小板聚集和活化血小板脱颗粒现象(P＜0.05或0.01),大黄素对凝血酶诱导的血小板粘附抑制率达38.54％,对巨噬细胞活化后亚硝酸盐的产生也有显著抑制作用(P＜0.05)。熊果酸对血小板聚集无任何抑制作用。　　 机制探讨:藤梨根提取物对血小板聚集的抑制作用可以被L-NAME阻断,ODQ仅能减弱而非完全阻断该作用。低浓度Foskolin与低浓度藤梨根提取物联用后能显著抑制血小板聚集。血小板的eNOS活性主要由蛋白磷酸化调节,Western blot结果显示藤梨根提取物可以时间依赖性促进eNOS-Ser1177位点的蛋白磷酸化表达,在药物处理10 min时达到峰值。eNOS活化后促进NO的生成,藤梨根提取物处理血小板15 min后能在一定程度上促进血小板源NO水平升高,该作用在ADP刺激下或随着处理时间的延长而显著增强。藤梨根提取物对凝血酶刺激的血小板内cGMP水平有显著的升高作用,同时不影响cAMP水平。藤梨根提取物还能促进cGMP下游VASP蛋白磷酸化的表达。　　 3.桑枝提取物具有良好的药理活性,但不同提取部位的作用侧重点不尽相同。桑枝提取物-1(黄酮含量50.24％)和桑枝提取物-2(醇提物经正丁醇萃取,过D101大孔树脂,70％乙醇洗脱部位)对巨噬细胞活化后过量NO的产生具有显著的抑制作用(P＜0.01),但均不能引起离体主动脉环舒张或抑制血小板聚集;桑枝提取物-3(主要是生物碱成分)的作用与之相反,对ADP、花生四烯酸和胶原诱导的大鼠体外血小板聚集(P＜0.05或0.01)有良好的浓度依赖性抑制作用。1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)是桑枝生物碱的主要成分,但实验结果显示,1-DNJ并不具备抗血小板聚集的作用。　　 4.苦参素对ADP、花生四烯酸和血小板活化因子诱导血小板聚集的抑制与对照组比较有统计学意义(P＜0.05),该作用不能被L-NAME和ODQ阻断,但苦参素能显著促进低浓度磷酸二酯酶抑制剂IBMX的抗聚集作用。苦参素维持血小板超微结构稳定主要表现为显著抑制ADP引起的血小板内致密颗粒释放(P＜0.01)和维持细胞膜完整。　　 5.芫花提取物能显著抑制花生四烯酸和凝血酶诱导的大鼠体外血小板聚集(P＜0.05或0.01),该作用不能被L-NAME和ODQ阻断。芫花提取物对内皮完整或去除内皮的离体血管环均有明显的舒张作用。　　 芹菜素是芫花的单体成分之一。芹菜素能显著抑制花生四烯酸诱导的血小板聚集和TXA2生成,对活化巨噬细胞过量NO的产生也有显著的抑制作用。芹菜素对血小板聚集和巨噬细胞活化的抑制效果与芫花提取物相似,这提示芫花提取物的抗聚集作用可能与抑制花生四烯酸代谢有关。　　 结论：　　 本文对具有抗炎或扩张血管作用的38个中药提取物进行抗血小板聚集作用筛选,得到16种有效提取物,其中7种对血小板聚集的抑制作用未见报道;　　 苦参素、芫花提取物、桑枝提取物-3(生物碱成分)、藤梨根提取物可以从多途径抑制血小板活化,同时具有舒张血管或抑制过量NO产生的作用;苦参素与IBMX有协同增效作用;桑枝提取物-3(生物碱成分)和芫花提取物对血瘀证相关指标的调节主要与抑制花生四烯酸代谢通路有关;藤梨根提取物舒张血管和对血小板功能的抑制主要与一氧化氮信息系统有关。