背景和目的舌鳞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)是头颈部肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一。它通常表现为恶性程度高、生长快、以及易发生淋巴结转移的特点。经典的肿瘤生物学理论认为,肿瘤的发生是某种或某些细胞因基因改变而导致其生长失控,缺乏分化以致恶性增生的结果。基于此理论,肿瘤治疗的主要策略是通过手术治疗,结合放疗、化疗以及生物治疗等手段,尽可能清除机体内的肿瘤细胞。虽然治疗的方法和手段不断进步,肿瘤治疗获得很大的成功,但是,对于处于舌鳞癌中晚期或者发生淋巴结转移的患者来说,其5年生存率依然很低。随着对肿瘤研究的不断深入和扩展,人们对肿瘤微环境的认识逐步加深。研究表明,肿瘤的发生发展进程不是由肿瘤细胞单独决定,而是由相互影响的肿瘤微环境和肿瘤细胞共同决定。癌相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)是肿瘤微环境中“活化”的成纤维细胞,也是肿瘤间质细胞中最主要的细胞成分。与正常组织中的成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs)或癌旁组织成纤维细胞(peri-tumor fibroblasts,PTFs)相比,CAFs高表达α-SMA,其分泌功能、运动能力和增殖能力更强。CAFs通过旁分泌形式(分泌多种生长因子或细胞因子,如MMPs、HGF、VEGF和TGF-β)或者通过和肿瘤细胞直接接触的方式来参与调节肿瘤组织血管生成、细胞外基质重建、上皮-间质化,甚至影响肿瘤的复发和耐药。因此,以CAFs为靶点,通过调控肿瘤微环境来影响肿瘤的生物学进程,在肿瘤防治方面有重要的研究价值。姜黄素是从植物姜黄中提取的天然色素,作为传统药物在中国和印度等国家广泛应用。在美国和日本,它通常被当成食品添加剂供人们食用。姜黄素安全性高,毒副作用少,单独或者和其他药物联合应用对于多种肿瘤(例如:结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌及头颈部恶性肿瘤)治疗有效。以往,关于姜黄素抑制肿瘤方面的研究,多集中于关注其对肿瘤细胞的影响。实际上,除了肿瘤细胞,肌成纤维细胞也是姜黄素发挥作用的靶细胞之一。在非肿瘤组织中,姜黄素能够以“活化”的成纤维细胞-即肌成纤维细胞为靶点,抑制多个组织器官(肝、肺、肾、皮肤和口腔黏膜)的纤维化。CAFs作为肿瘤微环境中“活化”的成纤维细胞,姜黄素对舌鳞癌CAFs有何影响,目前还不清楚。因此,本研究首先获取舌鳞癌组织及癌旁组织,通过原代培养、分离、纯化出舌鳞癌CAFs和PTFs;观察姜黄素对舌鳞癌CAFs表型、促癌相关细胞因子的分泌表达以及增殖能力、运动能力影响；通过体外实验和体内实验观察姜黄素对CAFs促癌活性的影响,并初步探讨其可能的机制。为深入理解肿瘤细胞与肿瘤微环境之间的相互影响,甚至为肿瘤的防治提供实验和理论基础。材料与方法1.舌鳞癌及癌旁组织相关成纤维细胞的分离、纯化和鉴定新鲜的组织标本取自山东大学齐鲁医院颌面外科的临床手术切除的舌鳞癌组织及癌旁组织。采用组织块法培养,获得舌鳞癌CAFs和PTFs。在第一次和第二次细胞传代时,利用酶消化法和反复贴壁法对细胞进行分离和纯化。采用免疫组化技术检测α-SMA、vimentin和CK19表达,应用CCK8试剂盒检测CAFs和PTFs增殖能力。2.姜黄素对CAFs细胞表型和功能特征的影响采用CCK8试剂盒检测不同浓度0、5、10、20、40、60、80 μM姜黄素对CAFs和PTFs细胞活性的影响,筛选出对细胞活性无影响的最大药物浓度用于后续实验。CAFs和PTFs中分别加入姜黄素(对照组加入等量DMSO)处理后,Western blot检测细胞内a-SMA及p-Smad 2/3的蛋白表达;采用CCK8检测细胞增殖情况;RT-PCR检测MMP2、SDF-1、TGF-β1mRNA表达;ELISA试剂盒检测细胞培养上清液中MMP2、SDF-1、TGF-β1蛋白表达;利用Transwell小室检测姜黄素对CAFs和PTFs迁移和侵袭能力的影响。3.姜黄素对CAFs促癌活性的影响及可能的机制制备条件培养基:利用(经过或未经过姜黄素处理的)CAFs或PTFs条件培养基配制成含有4%FBS的完全培养基。体外培养Ca127细胞1、3和5 d,采用CCK8试剂盒检测各条件培养基对舌癌细胞Ca127增殖的影响;利用Transwell小室检测各条件培养基对舌癌细胞系Ca127迁移和侵袭的影响;将(经过或未经过姜黄素处理的)CAFs或PTFs与Ca127细胞按照1:2比例混合后,注入裸鼠腋下,建立混合移植瘤模型。根据移植瘤的体积和重量,分析CAFs对移植瘤生长的影响。HE染色观察移植瘤组织学的表现,免疫组化方法检测Ki67和α-SMA表达,初步探讨CAFs促进移植瘤组织生长的可能机制。结果1.成功分离纯化培养出CAFs和PTFsCAFs呈长梭形,与PTFs相比,CAFs形成的细胞突起较少且形态不均一,增殖能力更强;CAFs高表达a-SMA,同时也表达vimentin。PTFs表达vimentin,不表达或微弱表达a-SMA。CAFs和PTFs均不表达CK19。2.姜黄素促进CAFs表型向PTFs转化,抑制其增殖、分泌功能和运动能力本研究使用不同浓度的姜黄素处理CAFs和PTFs 24 h,采用CCK8试剂检测细胞活性,结果显示:当浓度低于10 μ时,姜黄素不影响CAFs、PTFs和Ca127的细胞活性；当浓度大于20 μM时,姜黄素以剂量依赖形式抑制CAFs和PTFs的活性。姜黄素对CAFs、PTFs和Ca127的半数有效抑制浓度(IC5024h)分别是39.79、41.81、49.90μM。我们选择10μM作为后续实验的药物浓度。在10μM 姜黄素的作用下,姜黄素抑制CAFs增殖、抑制促癌相关细胞因子MMP2、SDF-1、TGF-β1的分泌表达、使其运动能力下降;同时降低CAFs细胞内a-SMA的表达,促进CAFs表型逆转化成类似PTFs表型。伴随着CAFs表达a-SMA的水平降低,细胞内p-Smad2/3的水平也降低;而在此条件下,姜黄素对PTFs分泌功能、侵袭、迁移和a-SMA表达无显著影响。3.经过姜黄素处理的CAFs对舌癌细胞系Ca127增殖、迁移、侵袭和成瘤能力的促进作用降低细胞增殖实验、细胞迁移和侵袭实验结果显示:与仅含有4%FBS的对照组相比,各实验组条件培养基均促进舌癌细胞Ca127的增殖、迁移和侵袭。其中,CAFs条件培养基的作用最强;表型转化的CAFs条件培养基的促增殖作用降低,与PTFs条件培养基作用相当;姜黄素不影响PTFs对Ca127的增殖、迁移和侵袭的促进作用。相比于单纯的注入Ca127,混合CAFs后,形成的移植瘤体积和重量明显增加;混合表型转化的CAFs或混合(经过姜黄素处理和未经姜黄素处理的)PTFs,均不影响移植瘤体积和重量。HE染色结果显示,各组混合移植瘤组织中的间质成分增加;免疫组织化学染色结果显示,与CAFs混合,所形成的移植瘤组织中Ki67及a-SMA的表达高于其余各组。结论1.舌鳞癌CAFs和PTFs在细胞形态、功能特征以及细胞表型方面存在差异。2.低浓度姜黄素抑制CAFs表达a-SMA,诱导其表型转化成为类似PTFs表型;同时降低CAFs增殖能力、运动能力以及促癌相关细胞因子的分泌表达。3.低浓度姜黄素显著降低CAFs的促癌活性,CAFs可能通过促进Ca127的增殖促进移植瘤的生长。