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目的:急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是一种除外心源性因素,可由各种直接或间接的复杂致病因素导致的急性、进展性肺功能衰竭综合征。若未得到有效干预,ALI患者肺功能可持续恶化,进展为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)。尽管关于急性肺损伤发病机制的分子水平研究已经有了大量报道,但目前仍无有效的临床治疗药物或手段。目前普遍认为,中性粒细胞在ALI的发生发展中占据至关重要的作用。中性粒细胞作为固有免疫系统中的一线防御细胞,可以分泌包括TNF-α、IL-1β、IL-8、IFN、IP-10、MIP-1等在内的炎症因子或趋化因子,抗炎方式呈现出多样化。中性粒细胞可以在受到外界病原体、细胞因子、激活的血小板甚至血红素的刺激时,能释放中性粒细胞胞外核酸网(neutrophil extracellular traps,NETs)。NETs可以捕杀入侵机体的细菌、病毒、真菌等病原体,但是过度的NETs形成可能对机体组织造成损害。已有大量文献报道NETs参与了血栓形成、自身免疫疾病以及输血相关急性肺损伤等疾病的发生发展过程。血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是血红素代谢的关键酶,可将血红素代谢为无细胞毒性的Fe2+、CO和胆绿素。HO-1具有良好的抗炎、抗凋亡的作用已被广泛认可,但关于HO-1是否参与ALI中NETs形成的调控,及HO-1带来的NETs调控在ALI炎症损伤上发挥的作用尚未见相关报导。本研究利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的ALI小鼠模型联合HO-1激动剂钴原卟啉(cobalt protoporphyrin,Co PP)干预,观察HO-1的表达上调是否能够通过负向调节NETs的形成,最终改善ALI的炎症反应程度。方法:120只16-18 g雄性C57BL/6小鼠适应性喂养1周后,随机分组。根据造模药物LPS、干预药物Co PP及对照剂无菌生理盐水(normal saline,NS)的使用,将实验动物分为生理盐水组(NS组)、脂多糖组(LPS组)、脂多糖+生理盐水组(LPS+NS组)以及脂多糖+钴原卟啉组(LPS+Co PP组),每组各30只。采取经腹腔注射LPS法建立实验性ALI模型,按5 mg/kg的用量注射LPS(1 mg/m L)或者同等体积的无菌生理盐水。LPS+Co PP组及LPS+NS组均在注射LPS造模之前4 h,分别预先经腹腔注射给予Co PP(5 mg/kg)或者同等体积的无菌生理盐水做对照。造模后第1、3、7 d分别取材,每个时间点每组取一半数量小鼠,在用无水乙醚麻醉后,摘眼球放血处死小鼠,留取血浆,同时行经支气管肺泡灌洗,收集保存支气管肺泡灌洗液(bronchial alveolar lavage fluid,BALF);另一半小鼠左肺用于病理学检测,通过进行HE染色观察肺泡、肺间质炎症浸润情况,采取脱氧核糖核酸(DNA)、髓过氧化物酶(MPO)、histone H2B的三色免疫荧光激光共聚焦显微镜成像观察肺组织NETs形成情况。采用BCA蛋白定量法检测BALF中总蛋白含量。使用Pico Green法检测BALF及serum中ds DNA的含量。ELISA检测BALF及serum中IL-8、MCP-1含量。使用乳酸盐脱氢酶(LDH)试剂盒用微板法检测BALF中LDH活性。右肺分别提取总RNA或总蛋白,采用RT-PCR联合2-△△Ct计算方法检测评估HO-1 m RNA相对于β-actin的表达量,蛋白免疫印迹法(western blot)检测MPO蛋白水平。结果:1 Co PP减轻了LPS诱导的小鼠肺部炎症反应1)HE染色显示,与NS组相比,LPS组及LPS+NS组在第1 d就可见肺泡间隔水肿增厚、间质及肺泡腔内炎性细胞增生、浸润,并可观察到红细胞渗出,炎症评分(inflammation score,IS)明显增高(P<0.01),于第3天达到峰值。而经过Co PP干预的LPS+Co PP小鼠肺组织损伤程度较小,且与LPS+NS组相比,在第1 d的炎症细胞浸润程度就得到减轻,在第3 d后观察不到明显的肺泡出血或肺水肿,IS均显著降低(P均<0.01)。到第7 d后各组炎症反应均得到好转,IS差异并无统计学意义。2)BALF蛋白定量结果显示NS组各时间点BALF蛋白含量并无明显差异。LPS组及LPS+NS组小鼠第1 d、第3 d的BALF蛋白含量均明显高于NS组,差异具有统计学意义(P<0.01)。LPS+Co PP组小鼠BALF蛋白含量在第1 d、第3 d都明显低于LPS+NS组,差异均具有统计学意义(P<0.01)。到第7 d各组之间BALF中蛋白含量无明显差异。3)趋化因子IL-8、MCP-1的含量检测结果显示,在第1 d、第3 d LPS组及LPS+NS组小鼠BALF及serum中IL-8及MCP-1水平都显著高于NS组(P<0.01)。与LPS+NS组相比,LPS+Co PP组小鼠在第1 d开始,BALF中IL-8的水平就降低(P<0.01),且在第三天持续降低,差异具有统计学意义(P<0.05),其MCP-1的水平在第1 d仅有下降趋势,在第3d时MCP-1水平才显著低于LPS+NS组(P<0.01)。4)LDH活性测定结果显示,LPS组及LPS+NS组小鼠BAFL上清中LDH活性在第1 d显著高于NS组(P<0.01),分别达到了平均值268.653U/L、266.590U/L,且在第3 d达到高峰(P<0.01),平均值分别为369.513U/L、403.438U/L;LPS+Co PP组小鼠BALF中LDH活性在第1 d就明显低于LPS+NS组(P<0.01),且在第3 d持续改善(P<0.01)。造模后第7 d,各组小鼠BALF中LDH活性在趋于同一水平,差异无统计学意义。2 Co PP减少了LPS诱导的小鼠肺部中性粒细胞的浸润。肺组织中MPO蛋白水平的检测结果显示,在造模后第3 d,LPS组及LPS+NS组小鼠肺组织MPO蛋白相对表达量均显著高出NS组(P均<0.01)。相对于LPS组及LPS+NS组,LPS+Co PP组小鼠MPO蛋白的相对表达水平显著降低(P<0.01)。3 Co PP对小鼠肺组织HO-1 m RNA表达的调控RT-PCR检测小鼠肺组织HO-1 m RNA表达量显示,第1 d及第3 d LPS+Co PP组小鼠肺组织HO-1 m RNA相对表达量均明显高于NS组、LPS组及LPS+NS组(P均<0.01),且在第3天达到高峰,到第7 d各组之间的差异无统计学意义。4 Co PP对LPS诱导的小鼠肺组织NETs形成的影响1)NETs存在于LPS诱导的ALI小鼠肺组织的证据。DNA、histone H2B和MPO三色免疫荧光激光共聚焦显微镜成像结果显示,造模后第1d,在LPS诱导的ALI小鼠肺组织区域内,尤其是肺泡腔周围,有DNA,Histone H2B和MPO三者相互融合结构存在,提示LPS诱导的ALI小鼠肺组织内存在NETs的产生。而NS组则未观察到类似的现象。2)Pico Green法检测ds DNA含量结果显示,LPS组和LPS+NS组小鼠BALF及serum中ds DNA的含量在第1 d均明显高于NS组,差异均具有统计学意义(P均<0.01);经过Co PP干预后的小鼠BALF及serum中ds DNA减低,在造模第3 d后,显著低于LPS+NS组,差异有统计学意义(P<0.01);造模后第7 d,各组小鼠BALF及serum中的ds DNA含量并无差异。结论:本研究首次证实在LPS诱导的实验性ALI小鼠模型中,血红素加氧酶-1诱导剂钴原卟啉通过上调血红素加氧酶-1的表达,可能通过加速血红素分解代谢、降低刺激中性粒细胞形成NETs的因素IL-8的水平,最终下调了血浆及肺泡中NETs含量的,同时缓解了LPS诱导的实验性ALI的炎症反应;此研究为以后的ALI临床预防及治疗策略中以HO-1为靶点提供了实验研究的基础。