草鱼亲本免疫处理后补体调节因子Ⅰ的变化特点及其功能研究

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草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国主要的淡水养殖鱼类,但因草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)引起的出血病长期严重制约草鱼养殖业的健康发展。草鱼体内存在抗GCRV的重要功能分子且免疫因子在应答GCRV时具有功能差异性,其抗GCRV主效功能分子的筛选确证对日后草鱼抗GCRV分子标记辅助育种具有重要意义。本研究探究了GCRV弱毒疫苗免疫处理草鱼母本不同免疫因子包括免疫球蛋白M(Immunoglobulin M,Ig M)、补体成分3(Complement component 3,C3)、溶菌酶(Lysozyme,LZM)、甘露糖结合凝集素(Mannose-binding lectin,MBL)、补体因子B(Complement factor B,Bf)、补体因子I(Complement factor I,CFI)的含量变化规律,并以草鱼补体激活途径中唯一具有酶解活性的补体调节因子CFI为对象,对其结构特征、组织表达及功能特性进行分析,旨在了解草鱼母源免疫因子含量变化规律,探明免疫因子CFI在草鱼抗GCRV免疫应答及补体激活途径中的作用,为日后抗GCRV草鱼分子辅助育种提供基因资源。本文主要研究结果如下:(1)母源免疫处理草鱼六种免疫因子含量变化规律通过GCRV弱毒疫苗免疫草鱼母本,并采用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,q RT-PCR)检测六种免疫因子的蛋白活性水平和基因表达水平,结果显示GCRV弱毒疫苗能够诱导草鱼母本产生免疫应答,并促使相应免疫因子在亲本体内富集表达,以防御外界病原体的入侵,其中CFI基因表达水平上调最为显著,说明CFI可能在草鱼抗GCRV免疫反应中发挥重要作用。(2)草鱼CFI结构特征及表达特性分析通过NCBI获取草鱼CFI cDNA序列并对其进行生物信息学分析,结果显示草鱼CFI蛋白N端有一段含18个氨基酸的信号肽,包含FIMAC、SR、LDLa1、LDLa2和Tryp_SPc五个结构域,且其蛋白序列中存在大量半胱氨酸保守位点。通过q RT-PCR和Western blot技术检测草鱼CFI在健康组织中及GCRV刺激后在肝脏中的表达特性,结果显示草鱼CFI在测定的8个组织(肝、脾、肾、头肾、肠、鳃、肌肉和皮肤)中均有表达,其中在肝脏中的表达水平最高。感染GCRV后,草鱼CFI在肝脏中的表达量呈现总体下调的趋势,表明经GCRV刺激后,机体将更多的CFI用于裂解C3b或C4b,从而防止草鱼补体系统的过度激活。(3)草鱼CFI功能特点研究通过构建草鱼CFI有信号肽和去除信号肽真核表达质粒,并在GCO细胞中进行瞬时转染,结果显示转染p EGFP-N1-CFI-NS(不含信号肽)细胞的绿色荧光和蛋白表达水平较p EGFP-N1-CFI-S(含信号肽)的多,证明草鱼CFI是一种分泌型蛋白,去除信号肽更有利于草鱼CFI在GCO胞内的积聚。构建草鱼CFI重组蛋白并将其与草鱼血清进行孵育,经r CFI处理后血清中的C3b浓度明显降低,证明CFI可通过负调控C3b来抑制补体系统激活。综上所述,GCRV弱毒疫苗免疫处理草鱼母本可增强其体内免疫因子的富集表达,但有一定的时效性;研究首次证明了CFI在草鱼中通过降解C3b负调控补体激活,并可能在机体免疫防御病毒感染中发挥重要作用。
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