第一部分TXNIP在糖尿病坐骨神经和高糖培养施万细胞中表达目的:本部分实验以STZ诱导的Ⅰ型糖尿病小鼠模型和体外高糖培养的大鼠施万细胞系为研究对象,检测糖尿病施万细胞（糖尿病小鼠坐骨神经和高糖诱导的施万细胞）中TXNIP蛋白和mRNA表达,初步探讨TXNIP与高糖诱导的施万细胞损伤之间的关系。方法:1.TXNIP在Ⅰ型糖尿病小鼠坐骨神经中表达将雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常组和糖尿病组,糖尿病组腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin,STZ,p H值4.5,150mg/kg体重）构建Ⅰ型糖尿病模型,正常对照组注射相当体积的枸橼酸盐缓冲液,药物注射72h后进行鼠尾血糖测定,如果空腹血糖≥16.7mmol/L确定为成功,每周鼠尾测血糖,不合格者弃去。小鼠成模16周后分离提取坐骨神经,取适量坐骨神经固定于4%多聚甲醛固定液和戊二醛电镜液;余下坐骨神经组织保存于-80℃。免疫组织化学和Western blot检测小鼠坐骨神经TXNIP蛋白表达;Real-time PCR检测小鼠坐骨神经TXNIP mRNA表达;免疫荧光检测小鼠坐骨神经TXNIP和MBP表达;透射电镜观察小鼠坐骨神经形态学变化;电生理检测小鼠坐骨神经传导功能。2.TXNIP在体外高糖刺激的施万细胞中表达大鼠施万细胞（rat Schwann cells,RSC96）购自北京协和细胞资源中心中国医学科学院,人施万细胞（human Schwann cell,HSC）购自北京北纳生物,两种细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基,5%CO2、37℃恒温培养箱中培养。大鼠原代施万细胞（primary rat Schwann cell,PRSC）是在新生SD乳鼠坐骨神经中提取,在含20%胎牛血清的DMEM培养基,5%CO2、37℃恒温培养箱中培养。检测高糖对施万细胞中TXNIP蛋白表达的影响:将RSC96、HSC和PRSC细胞随机分为3组,分别为正常糖组（5.5mmol/L glucose,normal glucose,N）、高糖组（25mmol/L glucose,high glucose,H）和甘露醇组（5.5mmol/L glucose+19.5mmol/L mannitol,M）,Western blot检测高糖刺激施万细胞24、48和72 h后TXNIP蛋白表达;免疫荧光检测高糖刺激施万细胞24 h后TXNIP蛋白表达;Real-time PCR检测高糖对RSC96细胞TXNIP mRNA表达的影响;将RSC96细胞随机分为正常组和高糖组,高糖刺激细胞48 h后收集细胞,RNA-seq分析差异基因表达。结果:1.TXNIP在Ⅰ型糖尿病小鼠坐骨神经中表达Western blot结果显示:与正常组相比,糖尿病小鼠坐骨神经中TXNIP蛋白表达明显升高（P<0.05）;免疫组化结果显示:与正常组相比,糖尿病小鼠坐骨神经中TXNIP阳性区域的IOD值表达增加3.04倍（P<0.05）;Real-time PCR结果显示:与正常组相比,糖尿病小鼠坐骨神经中TXNIP mRNA表达增加7.62倍（P<0.05）;免疫荧光双染结果显示:施万细胞生物标志物MBP和TXNIP表达共定位。2.Ⅰ型糖尿病小鼠坐骨神经传导功能和髓鞘形态学变化电镜观察结果显示:与正常小鼠相比,糖尿病小鼠坐骨神经髓鞘结构异常,髓鞘出现内折或者断裂;电生理检测发现:与正常小鼠相比,糖尿病小鼠坐骨神经中的动作电位幅度和传导速度分别下降了37.76%和27.36%（P<0.05）。3.TXNIP在体外高糖培养的施万细胞中表达RNA-seq结果显示:与正常组相比,高糖刺激RSC96细胞48 h后TXNIP的FPKM（Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped reads）值增加339.87倍（P<0.05）;Western blot结果显示:与正常组相比,高糖刺激RSC96细胞24 h和48 h后TXNIP表达分别增加13.47倍和13.20倍（P<0.05）;免疫荧光结果显示:TXNIP蛋白在RSC96细胞胞核和胞浆中表达,与正常组相比,高糖刺激导致TXNIP蛋白在RSC96细胞胞浆中表达增多。高糖刺激HSC细胞24、48、72 h后,TXNIP蛋白水平表达也均明显增强（P<0.05）;免疫荧光结果显示:与正常组相比,高糖刺激导致TXNIP蛋白在HSC细胞胞浆中表达增多。RPSC细胞结果显示:与正常组相比,高糖刺激RPSC细胞24 h后,TXNIP蛋白水平表达增加4.4倍（P<0.05）。小结:Ⅰ型糖尿病小鼠坐骨神经和体外高糖培养的施万细胞中TXNIP蛋白和mRNA表达均明显增多。第二部分TXNIP对糖尿病施万细胞自噬和凋亡的影响目的:本部分实验以STZ诱导的Ⅰ型糖尿病模型（基因敲除小鼠）和体外高糖培养的RSC96细胞为研究对象,检测糖尿病施万细胞中TXNIP与凋亡和自噬相关蛋白的关系。方法:1.TXNIP基因敲除对糖尿病小鼠坐骨神经传导功能、自噬和凋亡的影响将小鼠分为野生型小鼠、野生型糖尿病小鼠（TXNIP+/+）和TXNIP基因敲除糖尿病小鼠（TXNIP-/-）,糖尿病造模方法同第一部分。小鼠坐骨神经取材以及组织处理同第一部分。免疫组织化学检测小鼠坐骨神经中LC3、cleaved caspase 3和BAX蛋白表达;透射电镜观察小鼠坐骨神经形态学变化;电生理检测小鼠坐骨神经传导功能。2.TXNIP对RSC96细胞凋亡和自噬功能的影响检测高糖对RSC96细胞凋亡和自噬相关蛋白表达的影响:将RSC96细胞随机分为正常糖组（5.5 mmol/L glucose,normal glucose,N）和高糖组（25 mmol/L glucose,high glucose,H）;Western blot检测RSC96细胞中LC3、cleaved caspase 3和caspase 3表达。检测过表达TXNIP对正常培养RSC96细胞中凋亡和自噬相关蛋白表达的影响:将正常培养RSC96细胞随机分为空载质粒组（NC）和TXNIP过表达质粒组（pc DNA3.1-TXNIP OE）,质粒转染48 h后,Western blot检测RSC96细胞中BAX、LC3表达;免疫荧光检测RSC96细胞中cleaved caspase 3表达。检测敲低TXNIP对高糖刺激的RSC96细胞中凋亡和自噬相关蛋白表达影响:将高糖培养RSC96细胞随机分为空载质粒组（control sh RNA）和TXNIP敲低质粒组（TXNIP sh RNA）,质粒转染48 h后,Western blot检测RSC96细胞中LC3、cleaved caspase 3和caspase 3表达;免疫荧光检测RSC96细胞中LC3、BAX和cleaved caspase 3表达。结果:1.TXNIP基因敲除对糖尿病小鼠坐骨神经传导功能以及自噬和凋亡的影响电生理结果显示:与野生型糖尿病小鼠相比,TXNIP基因敲除糖尿病小鼠坐骨神经动作电位幅度增加了1.33倍（P<0.05）,传导速度提高了1.78倍（P<0.01）。电镜结果显示:与野生型糖尿病小鼠相比,TXNIP基因敲除糖尿病小鼠的坐骨神经髓鞘异常情况得到明显改善。免疫组化结果显示:与野生型糖尿病小鼠相比,TXNIP基因敲除糖尿病小鼠坐骨神经中LC3阳性表达明显增加;与野生型糖尿病小鼠相比,TXNIP基因敲除糖尿病小鼠坐骨神经中cleaved caspase 3和BAX表达降低。统计分析结果显示:cleaved caspase 3和BAX染色的IOD值分别降低了99.74%和98.23%（P<0.05）。2.上调TXNIP对体外培养的RSC96细胞自噬和凋亡的影响Western blot结果显示:在正常培养RSC96细胞中过表达TXNIP降低LC3-II/LC3-I比率,并增加促凋亡因子BAX表达。统计分析结果显示:与NC组相比,TXNIP OE组LC3-II/LC3-I比值降低了74.81%,TXNIP OE组BAX升高了1.22倍（P<0.05）。免疫荧光结果显示:与NC组相比,TXNIP OE组cleaved caspase 3表达增加。3.下调TXNIP对体外高糖培养的RSC96细胞自噬和凋亡的影响Western blot结果显示:在高糖培养的RSC96细胞中,敲低TXNIP可有效逆转高糖诱导LC3-II/LC3-I比值下调和cleaved caspase 3/total caspase 3比值上调。统计分析表明:与control sh RNA组相比,TXNIP sh RNA转染组LC3-II/LC3-I比值增加4.12倍,cleaved caspase 3/total caspase 3的比率降低了25.94%（P<0.05）。免疫荧光结果显示:与control sh RNA组相比,TXNIP sh RNA转染组LC3表达明显增加,cleaved caspase3和BAX表达减少。小结:在糖尿病环境下下调TXNIP增加了自噬指标LC3-II/LC3-I比值,降低了凋亡指标cleaved caspase 3/caspase 3和BAX表达,并且改善糖尿病小鼠的坐骨神经传导功能。第三部分DNMT对糖尿病施万细胞TXNIP蛋白表达、凋亡和自噬的影响目的:本部分研究以STZ诱导的Ⅰ型糖尿病小鼠模型和体外高糖培养的RSC96细胞为研究对象,检测糖尿病施万细胞中DNMT对TXNIP、凋亡和自噬的影响。方法:1.DNA甲基化抑制剂5-Aza对糖尿病小鼠坐骨神经传导功能、TXNIP和自噬和凋亡相关蛋白表达的影响将C57BL/6J小鼠随机分为糖尿病组（diabetic）和糖尿病5-Aza药物处理组（diabetic+5-Aza）,糖尿病造模方法同第一部分,5-Aza药物隔日腹腔注射,连续注射2个月,注射剂量为600μg/kg。小鼠坐骨神经取材以及组织处理同第一部分。电生理检测小鼠坐骨神经传导功能;免疫组化检测小鼠坐骨神经中LC3、BAX、cleaved caspase 3和TXNIP蛋白表达。2.DNA甲基化抑制剂5-Aza对高糖刺激的RSC96细胞TXNIP、自噬和凋亡相关蛋白表达的影响观察DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza对高糖培养的RSC96细胞中TXNIP、LC3和BAX表达的影响;RSC96细胞随机分为正常糖组（N）、高糖药物对照组（H+DMSO）和高糖5-Aza药物处理组（H+5-Aza）。Western blot和免疫荧光检测5-Aza药物处理RSC96细胞24 h后LC3-II/LC3-I、BAX和TXNIP蛋白表达。Real-time PCR检测5-Aza药物处理RSC96细胞24 h后TXNIP mRNA表达。3.高糖对RSC96细胞DNMT1和DNMT3a mRNA和蛋白表达的影响RSC96细胞随机分为正常糖组和高糖组。高糖刺激48 h后,RNA-seq检测正常和高糖环境中DNMT mRNA的表达;免疫荧光检测高糖培养的RSC96细胞中DNMT1和DNMT3a蛋白表达。4.DNMT1和DNMT3a对高糖培养的RSC96细胞TXNIP mRNA和蛋白表达的影响将高糖培养的RSC96细胞随机分为空载质粒组（p Genesil-1）、DNMT1敲低质粒组（p Genesil-1-DNMT1）和DNMT3a敲低质粒组（p Genesil-1-DNMT3a）,质粒转染48 h后,Western blot和免疫荧光检测细胞中TXNIP蛋白表达;Real-time PCR检测细胞中TXNIP mRNA表达。将高糖培养的RSC96细胞随机分为空载质粒组（pc DNA3.1）、DNMT1过表达质粒组（pc DNA3.1-DNMT1）和DNMT3a过表达质粒组（pc DNA3.1-DNMT3a）,质粒转染48 h后,Western blot检测细胞中TXNIP蛋白表达。5.DNA甲基转移酶抑制剂对高糖培养RSC96细胞中TXNIP蛋白表达的影响RSC96细胞随机分为正常糖组（N）、高糖药物对照组（H+DMSO）、高糖5-Aza药物处理组（H+5-Aza）、高糖5-Aza和MG132药物处理组（H+5-Aza+MG132）和高糖5-Aza和氯喹药物处理组（H+5-Aza+氯喹）,细胞培养24 h后,Western blot检测细胞中TXNIP蛋白表达。高糖培养的RSC96细胞随机分为空载质粒组（p Genesil-1）、DNMT3a敲低质粒药物对照组（p Genesil-1-DNMT3a+DMSO）,DNMT3a敲低质粒MG132药物处理组（p Genesil-1-DNMT3a+MG132）和DNMT3a敲低质粒氯喹药物处理组（H+p Genesil-1-DNMT3a+氯喹）,质粒转染48 h后,Western blot检测细胞中TXNIP蛋白表达。结果:1.5-Aza对糖尿病小鼠坐骨神经神经传导功能、TXNIP和自噬凋亡相关蛋白表达影响应用5-Aza药物处理后降低糖尿病小鼠坐骨神经中TXNIP蛋白表达,同时还改善了糖尿病小鼠坐骨神经传导速度和动作电位幅度。免疫组化结果显示:与糖尿病小鼠相比,5-Aza药物处理组小鼠坐骨神经中LC3蛋白表达增强,cleaved caspase 3蛋白表达降低。2.5-Aza对高糖刺激RSC96细胞中TXNIP、自噬和凋亡相关蛋白表达的影响Western blot结果发现:5-Aza处理可显著抑制高糖培养的RSC96细胞TXNIP蛋白表达。统计学分析:与H+DMSO组相比,H+5-Aza组TXNIP表达降低了77.33%（P<0.05）。与Western blot结果一致,免疫荧光也显示5-Aza药物处理可明显抑制高糖培养的RSC96细胞中TXNIP蛋白表达。Real-time PCR结果显示:DMSO对照组与5-Aza药物处理组在高糖培养的RSC96细胞中TXNIP mRNA表达并无明显变化,差异无统计学意义。Western blot结果显示:与H+DMSO组相比,H+5-Aza组LC3-II/LC3-I比值增加2.16倍,BAX表达降低了32.45%（P<0.05）。3.高糖培养的RSC96细胞中DNMT1和DNMT3a mRNA和蛋白表达的影响RNA-seq结果显示:与正常组相比,高糖培养RSC96细胞48 h后DNMT1 mRNA和DNMT3a mRNA表达增强,DNMT3b变化不明显。Western blot结果显示:与正常组相比,高糖培养RSC96细胞24 h和48h后,DNMT1蛋白表达分别增加了49.27%和54.17%,DNMT3a蛋白表达分别增加了26.31%和42%（P<0.05）。免疫荧光证实了Western blot的结果:高糖培养RSC96细胞48 h后,DNMT1和DNMT3a在细胞核中表达明显增强。4.DNMT1和DNMT3a对高糖培养的RSC96细胞中TXNIP mRNA和蛋白表达影响Western blot结果显示:在高糖培养RSC96细胞中,与pc DNA3.1组相比,p DNA3.1-DNMT1转染组和pc DNA3.1-DNMT3a转染组TXNIP蛋白表达增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。Western blot结果显示:在高糖培养的RSC96细胞中,与p Genesil-1组相比,p Genesil-1-DNMT1和p Genesil-1-DNMT3a转染组中TXNIP蛋白表达下降,统计分析表明:p Genesil-1-DNMT1和p Genesil-1-DNMT3a转染组TXNIP蛋白表达分别降低了29.3%和58.86%（P<0.05）。共聚焦显微镜观察结果显示:在高糖培养的RSC96细胞中,p Genesil-1-DNMT1和p Genesil-1-DNMT3a转染组TXNIP的表达减少。Real-time PCR结果显示:在高糖培养的RSC96细胞中,与p Genesil-1组相比,p Genesil-1-DNMT1或p Genesil-1-DNMT3a转染后TXNIP mRNA表达明显增加,统计结果显示:p Genesil-1-DNMT1和p Genesil-1-DNMT3a转染组TXNIP mRNA分别增加了1.8倍和2.16倍。5.检测DNMT对高糖培养RSC96细胞中TXNIP蛋白表达影响MG132（蛋白酶体抑制剂）和氯喹（自噬抑制剂）药物处理高糖培养的RSC96细胞,结果显示5-Aza抑制TXNIP蛋白表达,MG132处理后有效逆转TXNIP蛋白的降解,但氯喹未发挥明显作用。Western blot显示:高糖培养RSC96细胞中,与p Genesil-1组相比,p Genesil-1-DNMT3a转染组TXNIP表达减少,MG132处理后可有效逆转敲低DNMT3a诱导的TXNIP表达下调,但氯喹作用不明显。小结:在糖尿病施万细胞中TXNIP表达、自噬和凋亡是受到DNA甲基转移酶DNMT1和DNMT3a的调控,且DNMT1和DNMT3a对TXNIP的影响是在翻译后水平而非转录水平。第四部分DNA甲基化转移酶通过ITCH和NEDL3调控TXNIP蛋白降解目的:本部分实验以体外高糖培养的RSC96细胞为研究对象,检测糖尿病施万细胞中ITCH、NEDL3表达情况,以及与DNMT1、DNMT3a和TXNIP之间的关系,初步探讨RSC96细胞中上调DNMT1和DNMT3a增加TXNIP蛋白稳定性的具体调控机制。方法:1.高糖培养的RSC96细胞中ITCH和NEDL3蛋白和mRNA表达RSC96细胞随机分为正常糖组和高糖组,细胞培养处理48 h后,RNA-seq检测细胞中ITCH和NEDL3 mRNA的表达情况。RSC96细胞随机分为正常糖组和高糖组,高糖刺激12、24和48 h后,Western blot检测细胞中ITCH和NEDL3蛋白的变化。2.下调RSC96细胞中ITCH和NEDL3后检测TXNIP蛋白表达正常培养的RSC96细胞随机分为空载质粒组（p Genesil-1）、ITCH敲低质粒组（p Genesil-1-ITCH）和NEDL3敲低质粒组（p Genesil-1-NEDL3）,质粒转染48 h后,Western blot检测细胞中TXNIP蛋白表达。3.RSC96细胞中ITCH、NEDL3和TXNIP表达正常培养的RSC96细胞随机分为两组:一组细胞转染TXNIP过表达质粒和ITCH过表达质粒（p EGFP-N1-TXNIP+pm Cherry-ITCH）,一组细胞转染TXNIP过表达质粒和NEDL3过表达质粒（p EGFP-N1-TXNIP+pm Cherry-N1-NEDL3）,质粒转染48 h后,共聚焦显微镜观察RSC96细胞中ITCH、NEDL3和TXNIP表达情况。4.上调高糖培养RSC96细胞中NEDL3和ITCH后检测TXNIP蛋白表达高糖培养的RSC96细胞随机分为空载质粒组（PCDNA3.1）,NEDL3过表达质粒组（PCDNA3.1-NEDL3）,NEDL3过表达质粒和Ub过表达质粒组（PCDNA3.1-NEDL3+HA-Ub）,MG132处理NEDL3过表达质粒和Ub过表达质粒组（PCDNA3.1-NEDL3+HA-Ub+MG132）,质粒转染48 h后,Western blot检测细胞中TXNIP表达情况。高糖培养的RSC96细胞随机分为空载质粒组（PCDNA3.1）,ITCH过表达质粒组（PCDNA3.1-ITCH）,ITCH过表达质粒和Ub过表达质粒组（PCDNA3.1-ITCH+HA-Ub）,MG132处理NEDL3过表达质粒组和Ub过表达质粒组（PCDNA3.1-ITCH+HA-Ub+MG132）,质粒转染48 h后,Western blot检测细胞中TXNIP表达情况。5.上调或者下调RSC96细胞中DNMT1和DNMT3a后检测ITCH和NEDL3蛋白表达正常培养RSC96细胞随机分为空载质粒组（PCDNA3.1）、DNMT1过表达质粒组（PCDNA3.1-DNMT1）和DNMT3a过表达质粒组（PCDNA3.1-DNMT3a）;高糖培养RSC96细胞随机分为空载质粒组（p Genesil-1）、DNMT1敲低质粒组（p Genesil-1-DNMT1）和DNMT3a敲低质粒组（p Genesil-1-DNMT3a）;质粒转染48 h后,Western blot检测细胞中ITCH和NEDL3蛋白表达。6.上调或者下调RSC96细胞中DNMT1和DNMT3a后检测ITCH和NEDL3 mRNA表达正常培养RSC96细胞随机分为空载质粒组（PCDNA3.1）、DNMT1过表达质粒组（PCDNA3.1-DNMT1）和DNMT3a过表达质粒组（PCDNA3.1-DNMT3a）;高糖培养RSC96细胞随机分为空载质粒组（p Genesil-1）、DNMT1敲低质粒组（p Genesil-1-DNMT1）和DNMT3a敲低质粒组（p Genesil-1-DNMT3a）;质粒转染48 h后,Real-time PCR检测细胞中ITCH和NEDL3 mRNA表达。结果:1.高糖培养RSC96细胞中ITCH和NEDL3 mRNA和蛋白表达RNA-seq结果显示:与正常组相比,高糖培养RSC96细胞48 h后,ITCH和NEDL3 mRNA表达下降。Western blot检测高糖培养RSC96细胞12 h、24 h和48 h后ITCH和NEDL3蛋白表达,结果显示:随着高糖刺激时间增加,RSC96细胞中ITCH和NEDL3蛋白表达逐渐下降（P<0.05）。2.下调RSC96细胞中ITCH和NEDL3对TXNIP蛋白表达影响Western blot结果显示:与NC（空载质粒组）相比,ITCH敲低质粒组（ITCH sh RNA）和NEDL3敲低质粒组（NEDL3 sh RNA）TXNIP蛋白表达都显著增加,分别增加了37.5%和46.8%（P<0.05）。3.在RSC96细胞中检测ITCH、NEDL3和TXNIP表达情况共聚焦显微镜结果显示:在正常培养的RSC96细胞中分别转染了pm Cherry-N1-ITCH和p EGFP-N1-TXNIP质粒、pm Cherry-N1-NEDL3和p EGFP-N1-TXNIP质粒,发现在RSC96细胞中ITCH和NEDL3分别与TXNIP共表达。4.上调高糖培养RSC96细胞中NEDL3检测TXNIP蛋白表达Western blot结果显示:与空载质粒组（H+KB）相比,NEDL3过表达组（H+NEDL3 OE）TXNIP蛋白表达明显升高;与H+NEDL3 OE组相比,NEDL3过表达质粒组和Ub过表达质粒组（H+NEDL3 OE+HA-Ub）TXNIP蛋白表达降低,给予MG132处理后TXNIP蛋白表达明显回升（P<0.05）。5.在高糖培养的RSC96细胞中上调ITCH检测TXNIP蛋白表达Western blot结果显示:与H+KB对照组相比,H+ITCH OE组TXNIP蛋白表达明显升高;与H+ITCH OE组相比,H+ITCH OE+HA-Ub组TXNIP蛋白表达降低,给予MG132处理后TXNIP蛋白表达明显回升。6.在高糖培养RSC96细胞中下调DNMT1和DNMT3a后检测ITCH mRNA和NEDL3 mRNA表达Real-time PCR结果显示:与NC对照组相比,DNMT1敲低质粒组（Sh-DNMT1）和DNMT3a敲低质粒组（Sh-DNMT3a）ITCH mRNA表达分别增加了80.79%和91.72%（P<0.05）。Real-time PCR检测结果显示:与H+KB对照组相比,DNMT1敲低质粒组（Sh-DNMT1）和DNMT3a敲低质粒组（Sh-DNMT3a）NEDL3 mRNA表达分别增加62.90%和62.33%（P<0.05）。小结:在糖尿病施万细胞中DNMT1和DNMT3a表达上调后导致ITCH和NEDL3明显下调,减少TXNIP蛋白降解。结论:糖尿病施万细胞中DNMT1和DNMT3a表达上调,抑制了ITCH和NEDL3基因转录,提高了TXNIP蛋白稳定性,促进施万细胞凋亡和抑制自噬,促进糖尿病周围神经病的发生发展。