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研究背景：胰腺癌是一种高度恶性的消化道肿瘤,近年来在全球的发病率呈逐年上升趋势,而死亡率一直居高不下,5年生存率仅为3%-6%。目前胰腺癌的免疫逃逸机制尚未明确,而且针对胰腺癌的过继性细胞免疫治疗技术进展不大。已有研究表明肿瘤细胞分泌的exosome中含有microRNA (exosomal miRNA),是一种良好的血清学肿瘤标记物,并且exosomal miRNA通过参与细胞间通讯而在细胞免疫机制中发挥重要作用。但目前尚未有胰腺癌相关的exosomal miRNA及其免疫调控功能的研究报道,尤其是胰腺癌exosomal miRNA对树突状细胞(dendritic cell, DC)的分化和抗原递呈功能的影响及机制仍不清楚。因此探索胰腺癌相关的血清学exosomal miRNA标记物,阐明胰腺癌exosomal miRNA对DC分化和基因表达谱的影响,对胰腺癌的早期诊断,探索新的肿瘤免疫治疗方式具有重要意义。研究目的：(1)寻找胰腺癌相关的血清学exosomal miRNA标记物；(2)阐明胰腺癌exosome对DC/细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte, CTL)肿瘤杀伤能力的影响及机制,建立新的基于胰腺癌exosome活性成分的DC/CTL诱导及胰腺癌杀伤试验模型。(3)阐明胰腺癌exosome对DC基因表达谱的影响,预测胰腺癌exosomal miRNA与DC mRNA之间的标靶关系,并建立调控的网络结构图。研究内容：(1)收集胰腺癌、胰腺相关疾病和正常健康人的血清,通过RT-PCR方法检测血清中exosomal miR-21和miR-17-5p的相对表达水平,评价它们对胰腺癌的诊断价值,分析与胰腺癌分期、分化等临床病理因素的相关性；(2)建立DC/CTL诱导和杀伤胰腺癌细胞的体外试验模型,分别用胰腺癌exosome和exosome的裂解超滤液刺激DC/CTL,分别用Western-Blot和Elisa检测TNF-a和穿孔素蛋白在DC/CTL细胞中表达水平和培养基中的含量,CCK-8检测CTL的增殖速率和对PANC-1细胞的杀伤率。(3)q-PCR阵列检测胰腺癌exosome、未成熟DC、胰腺癌exosome刺激的DC(E-DC)中84种胰腺癌相关miRNA的表达水平,筛选出在胰腺癌exosome中高表达,并且在E-DC中也显著高表达的胰腺癌相关miRNA作为候选miRNA;采用基因芯片检测DC和E-DC的mRNA表达谱,筛选出E-DC中表达被沉默的mRNA作为候选mRNA;通过网络生物信息数据库预测候选miRNA和mRNA之间的标靶关系,构建miRNA-mRNA调控网络结构图。研究结果：(1)胰腺癌患者的血清中exosomal miR-21和miR-17-5p表达水平与正常健康人和良性胰腺肿瘤患者相比有显著升高,血清exosomal miR-21和miR-17-5p诊断胰腺癌的ROC曲线下面积分别为0.887和0.897,血清exosomal miR-17-5p的表达水平与胰腺癌分期和远处转移存在相关性。(2)胰腺癌exosome抑制DC/CTL的增殖和细胞中穿孔素蛋白和TNF-a的表达,抑制DC/CTL对胰腺癌的杀伤效应；用胰腺癌exosome的裂解超滤液可以提高DC/CTL对胰腺癌的特异性杀伤效果。(3)exosome中含量较高的miR-101-3p、miR-202-3p等12种胰腺癌相关miRNA在E-DC中的表达水平也显著升高；在E-DC中,4929种基因表达受到抑制,其中有208种mRNA转为阴性(0)；通过生物信息学方法预测12种胰腺癌相关miRNA与208种mRNA存在着标靶关系；调控MHC Ⅱ类分子表达的关键基因RFXAP的表达水平由DC中的强阳性(6.77)转为E-DC中的阴性(0),并且可能与miR-203、miR-101-3p等4种候选miRNA存在标靶关系。结论：(1)血清exosomal miR-21和miR-17-5p检测有助于胰腺癌的早期诊断和鉴别诊断,血清中异常升高的exosomal miR-17-5p对胰腺癌的分期、手术适应征的选择和预后判断具有重要的参考价值。(2)胰腺癌exosome通过抑制DC/CTL中TNF-a和穿孔素蛋白表达来抑制DC递呈抗原和激活CTL的功能,可能在胰腺癌免疫逃逸中发挥重要作用；我们建立了一种基于胰腺癌exosome裂解超滤液的DC/CTL诱导方案,可以显著提高DC/CTL对胰腺癌的特异性杀伤效果。(3)胰腺癌exosome刺激DC后,miR-101-3p等多种胰腺癌miRNA依靠exosome途径转运进入DC中高表达,并影响DC中RFXAP等多种基因的表达,可能与DC中MHC II类分子表达下调和抗原递呈功能下降有关,在胰腺癌免疫逃逸中发挥重要作用；我们成功预测并构建了胰腺癌exosomal miRNA与DC mRNA的标靶关系的调控网络图,从而为下一步深入研究胰腺癌通过exosomal miRNA途径调控DC基因表达的机理指明了研究方向。