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淋巴瘤(Malignant lymphoma，ML)属于来自淋巴结或其它淋巴造血组织如胸腺、骨髓、脾等的血液系统恶性肿瘤，淋巴瘤可分为霍奇金淋巴瘤(HodgkinSlymphoma，HL)和非霍奇金淋巴瘤(non-HodgkinS lymphoma，NHL)。其中非霍奇金淋巴瘤又可分为B细胞、T细胞及NK/T细胞淋巴瘤，其中NK/T细胞淋巴瘤(NK/T-Cell Lymphoma,NKTCL)肿瘤细胞既有T细胞表型又有NK细胞表型，该病在西方国家比较罕见，在亚洲地区发病率稍高但也属于罕见病。NK/T细胞淋巴瘤常侵犯淋巴结以外组织器官，比如最常累及鼻腔与鼻咽部位，因其肿瘤细胞分泌穿孔素和颗粒酶，时常造成病变部位组织溃烂、穿孔等，部分病人以上腭穿孔为症状就诊，除此之外还可侵犯食管、皮肤、睾丸、中枢及骨髓等部位。NK/T细胞淋巴瘤病因尚不明确，有研究提出可能与EB病毒的慢性感染密切相关，但其具体作用机制并不明确。NK/T细胞淋巴瘤又可分为局限期和结外期，对于早期NK/T细胞淋巴瘤，研究发现采取放化疗结合疗效优于单纯放疗或单纯化疗，大多预后较好;而结外NK/T细胞淋巴瘤具有侵袭性强，化疗反应性差，预后差等特点，目前国际尚无统一治疗标准。进展期的结外侵犯NK/T细胞淋巴瘤，以吉西他滨为基础药物的DDGP(吉西他滨、培门冬酶、顺铂、地塞米松)方案在复发难治的结外NK/T细胞淋巴瘤患者中取得了较好的疗效，但仍有患者出现原发耐药或获得性耐药导致治疗失败，从而影响该病的整体预后。 水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)是水、甘油转运蛋白，在多种肿瘤中广泛表达，在细胞迁移、血管生成、肿瘤形成和肿瘤发展中发挥重要作用。AQP3(Aquaporin3)在很多肿瘤细胞上都有研究，AQP3在肺癌、结肠癌、食管和口腔鳞癌中均过表达。此外，在肝细胞癌和胰腺导管腺癌中，AQP3与AQP5双表达。AQP3过表达与胃腺癌的组织学分类、淋巴结转移、淋巴管浸润有关，导致患者生存期较低，与AQP3表达较低的患者相比较短。同样，在一项对乳腺浸润性导管癌患者的研究中，观察到AQP3表达增加。这与更高的组织学分级和向淋巴结扩散的增加有关，强调了AQP3在乳腺癌进展中的重要性。而在一项对膀胱癌患者的研究中，肿瘤分期高与AQP3表达水平降低有关。但AQP3在NK/T淋巴瘤中的作用尚无报道。 前期通过高通量测序技术筛选人NK/T细胞淋巴瘤细胞敏感株(YTS)与耐吉西他滨细胞株(YTSR)差异表达基因，研究表明吉西他滨耐药细胞株中AQP3的表达上调，而AQP3在NK/T细胞淋巴瘤对吉西他滨耐药中的作用情况尚不清楚，本研究通过构建过表达AQP3质粒并转染NKTCL细胞株YTS，以空载体组作为空白对照，Western blot及PCR验证过表达效果，用不同的浓度的吉西他滨(Gemcitabine，GEM)作用于空白对照组及过表达组细胞，使用CCK8(CellCounting Kit-8)法检测两组细胞对吉西他滨的敏感性，用流式细胞仪(FlowCytometer,FMC)AnnexinV-PI方法检测对细胞凋亡的影响，利用Western blot法检测凋亡及自噬等相关蛋白的表达差异。希望该研究为NK/T细胞淋巴瘤的治疗寻找到新的治疗靶点，在NK/T细胞淋巴瘤对吉西他滨耐药问题上有所突破，从而提高该病的治疗疗效改善预后。 目的： 1.探究水通道蛋白3(AQP3)在NK/T细胞淋巴瘤细胞对吉西他滨耐药中的作用; 2.研究其中可能的分子作用机制。 方法： 1.构建及验证AQP3过表达质粒:利用基因组DNA扩增AQP3开放阅读框(ORF)，将PCR产物连接到经EocR1和Not1双酶切后的载体上，构建AQP3过表达质粒。实时荧光定量PCR和测序验证AQP3过表达质粒。 2.慢病毒包装及转染NK/T细胞淋巴瘤细胞(YTS):利用验证成功的AQP3过表达质粒进行重组包装，Lipo6000转染293T细胞后收毒，利用Polybrene基因转染增强剂转染YTS细胞后流式测定细胞转染率，获得稳定过表达AQP3的YTS细胞，标记为YTS-AQP3high(携带GFP)，而空载体组标记为YTS-Ctrl。实验分组分为两组:YTS-Ctrl组和YTS-AQP3high组。 3.细胞的培养:悬浮细胞YTS-Ctrl和YTS-AQP3high分别在含有10％的胎牛血清的1640培养基中培养，每2-3天离心并更换新的培养液重悬细胞。293T细胞属于贴壁细胞，于10cm培养皿中培养，细胞培养基含有90％高糖DMEM+10％胎牛血清，每2-3天根据细胞计数及状态传代。细胞均放置于温度为37℃、5％C02的培养箱中。 4.CCK8法检测两组细胞增殖抑制率:利用CCK8法分别检测不同浓度的GEM(0、1.25、2.5、5、10、20nM/L)作用于YTS-Ctrl和YTS-AQP3high48小时和72小时的细胞增殖抑制水平。每种条件下均设3个复孔。设置酶标仪为波长在450nm时的吸光度，得到每孔对应的OD值，记录各组数据并计算其平均值±标准差。 5.AnnexinV-PI检测细胞凋亡:不同浓度GEM(0、5、10、20nM/L)作用于两组细胞48小时后，利用AnnexinV-PI的方法检测吉西他滨诱导的细胞凋亡的水平。 6.Western blot法检测蛋白表达量:YTS-Ctrl和YTS-AQP3high细胞在相同剂量的GEM(10nM/L)作用48小时后提取各组蛋白，检测凋亡相关及自噬相关蛋白的表达情况，GAPDH作内参。 7.采用SPSS22.0软件和GraphPad Prism5.01软件统计分析数据及绘图。各组数据均以平均值±标准差来表示。两组数据间比较采用t检验。p＜0.05则认为有显著的统计学差异。 结果： 1.稳定过表达AQP3的NK/T细胞淋巴瘤细胞(YTS-AQP3high)构建成功。 2.NK/T淋巴瘤细胞中AQP3的表达水平与其对化疗药物吉西他滨的敏感性相关:高表达AQP3后，YTS-AQP3high对吉西他滨产生一定耐药性，同等浓度的GEM对YTS-Ctrl组的细胞增殖抑制率明显高于YTS-AQP3high组(p＜0.05);同等浓度GEM作用48h后，YTS-Ctrl组的凋亡率明显高于YTS-AQP3high组(p＜0.05);过表达AQP3可促进NKTCL细胞增殖，抑制细胞凋亡。 3.过表达AQP3后，YTS-AQP3high凋亡通路相关蛋白Caspase-3表达降低(p＜0.05));自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达差异不显著(p＞0.05)。 结论： 水通道蛋白3过表达能够诱导NKTCL细胞对吉西他滨耐药，可能通过下调Cleaved caspase-3诱导产生耐药作用，耐药机制与自噬的关系仍需进一步研究。