【摘 要】
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目的:建立体外人视网膜微血管内皮细胞(human retinal microvascular endothelial cells,HRMECs)高糖模型,观察高糖环境下HRMECs的凋亡情况。通过检测白介素-37(interleukin-37,IL-37)在正常和高糖环境下HRMECs中的表达情况,探讨IL-37在高糖诱导的HRMECs凋亡中的作用。方法:1.通过细胞免疫荧光染色法鉴定本实验细胞为
【基金项目】
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国家自然科学基金资助项目(81660162);
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目的:建立体外人视网膜微血管内皮细胞(human retinal microvascular endothelial cells,HRMECs)高糖模型,观察高糖环境下HRMECs的凋亡情况。通过检测白介素-37(interleukin-37,IL-37)在正常和高糖环境下HRMECs中的表达情况,探讨IL-37在高糖诱导的HRMECs凋亡中的作用。方法:1.通过细胞免疫荧光染色法鉴定本实验细胞为HRMECs。2.CCK-8法检测在不同葡萄糖浓度(5.5 mmol/L、20 mmol/L、35 mmol/L、50 mmol/L)和不同时间(24 h、48 h、72 h)下HRMECs活力。3.流式细胞术(Annexin V-FITC/PI染色)检测经5.5 mmol/L、20 mmol/L、35 mmol/L、50 mmol/L,甘露醇(35 mmol/L)处理48 h后HRMECs的凋亡率,用Hoechst33342染色法观察正常对照组(5.5mmol/L)、高糖组(35 mmol/L)和甘露醇组(35 mmol/L)HRMECs凋亡情况。4.q RTPCR和western blot检测正常对照组(5.5 mmol/L)、高糖组(35 mmol/L)组HRMECs中Bax、Caspase 3、Bcl-2、IL-1βm RNA及蛋白的表达情况。5.q RT-PCR法检测正常对照组(5.5 mmol/L)、高糖组(35 mmol/L)HRMECs中IL-37m RNA表达情况。6.ELISA法检测正常对照组和高糖组(35 mmol/L)细胞上清液中IL-37表达情况。结果:1.本实验所用细胞特异性标记抗体CD31、Factor Ⅷ表达阳性,为本实验所需细胞HRMECs。2.CCK-8法结果显示,随着浓度及时间增加,HRMECs细胞活力降低,HRMECs在35 mmol/L葡萄糖浓度中培养48 h,细胞活力较正常对照组明显下降(P<0.05)。3.流式细胞术结果显示:HRMECs在35 mmol/L、50 mmol/L较正常对照组(5.5 mmol/L)凋亡率增加,甘露醇组、20 mmol/L组和正常对照组相比差异不明显。Hoechst33342结果显示,与正常对照组相比HRMECs在高糖环境细胞凋亡增加(P<0.05),细胞数量减少;q RT-PCR和WB结果显示:与正常对照组相比,高糖组(35 mmol/L)凋亡蛋白(Bax、Caspase3)、IL-1β mRNA及其蛋白表达增高,抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA及其蛋白表达下降。4.qRT-PCR结果显示:与正常对照组相比,高糖诱导的HRMECs中IL-37 mRNA表达量增加(P<0.05)。5.ELISA结果显示高糖组(35 mmol/L)细胞培养上清液中IL-37较正常对照组增高(P<0.05)。结论:(1)随着葡萄糖浓度的增加,体外培养的HRMECs活力降低,凋亡率增加。35mmol/L葡萄糖浓度干预48 h为本实验体外高糖培养HRMECs的最佳浓度及时间。(2)高糖环境下,IL-37在HRMECs中表达增加,可能参与HRMECs凋亡过程。
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