目的:疟疾是经按蚊传播的寄生虫感染性疾病。疟原虫生命周期多个阶段均有运动能力,其运动能力是疟疾传播的基础。疟原虫运动是一种顶复门生物特有的滑行运动,是一种基质依赖性运动,需要滑动体提供动力。滑动体的正确组装对于原虫的运动能力有着重要作用。滑动体的核心Myo A蛋白通过酰化的滑动体相关蛋白GAP45蛋白与内膜复合体相连,GAP45蛋白与内膜复合体上的GAP40蛋白和GAP50蛋白结合。滑动体相关蛋白GAP40是近期发现的滑动体新组分,定位于内膜复合体上,拥有10个跨膜区。GAP40蛋白C端具有多个磷酸化位点,是滑动体各组分中磷酸化水平最高的蛋白。鉴于滑动体在恶性疟原虫生长发育中的重要作用,本研究拟通过分子生物学方法检测Pf GAP40蛋白在恶性疟原虫红内期的表达和定位,以及在红内期生长发育中的作用机制,并初步检测3个磷酸化位点的作用,以期为滑动体的结构和功能提供新的内容。方法:本研究通过生物信息学分析预测GAP40蛋白磷酸化位点。采用CRISPR-Cas9及glm S-riboswitch技术构建Pf GAP40蛋白条件性敲减虫株(conditional knockdown strain,GAP40c KD),采用selection-linked integration（SLI）技术构建Pf GAP40蛋白磷酸化位点突变株(GFP::Pf GAP40Mut)。采用间接免疫荧光法（IFA）和免疫印迹技术（Western blot）检测Pf GAP40在红内期的定位和表达情况。通过加入葡萄糖胺（glucosamine,Glc N）敲减Pf GAP40蛋白,评估GAP40c KD株在红内期的生长发育情况。通过透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope,TEM）观察Pf GAP40蛋白敲减（Knock down,KD）后内膜复合体的形成情况。通过SLI技术突变Pf GAP40蛋白各磷酸化位点。通过红内期倍增实验和裂殖体侵袭等实验,评估Pf GAP40蛋白各磷酸化位点的功能。结果:1、通过基因型PCR鉴定和Western blot检测结果提示,成功构建并筛选出Pf GAP40c KD虫株。2、Western blot结果显示,Pf GAP40在红内期各时期均有表达,且在裂殖体时期表达量达峰。IFA显示,Pf GAP40蛋白与GAP45蛋白共定位（Pearson’s相关系数,0.91-0.98）。3、采用2.5 m M GLc N处理Pf GAP40c KD克隆株7（C7）,可显著降低疟原虫中Pf GAP40蛋白的表达水平（P＜0.001）。红内期表型分析显示:Pf GAP40蛋白敲减导致恶性疟原虫GAP40c KD株红内期生长发育完全阻断,第二周期无新生环状体出现。在滋养体期（24 hpi）进行敲减,可完全阻断裂殖子重新入侵红细胞,而在早期裂殖体（36 hpi）或晚期裂殖体（40 hpi）进行敲减,则可降低96%和67%的再侵袭后感染率。4、TEM检测显示:Pf GAP40KD后不影响内膜复合体结构的完整性。5、与对照组(GAP40c KD,Glc N-,25.8%)相比,Pf GAP40 KD株（Glc N+,25.5%）,PVM在裂殖体晚期破裂率无显著差异。6、GAP40晚期裂殖体组分蛋白免疫印记法和IFA结果显示,GAP40KD影响GAP45的定位和蛋白可溶性。7、基因型PCR鉴定和Western Blot检测显示:GFP::Pf GAP40突变株的成功构建。8、与野生型对照组相比,Pf GAP40蛋白Ser370、Ser372、Ser376位点突变虫株在第二个红内期发育周期后感染率明显下降,环状体生成率下降＞1.4倍。结论:1、GAP40蛋白是疟原虫生长发育的必需蛋白。2、GAP40蛋白敲减不影响裂殖体发育成熟,但阻断裂殖子侵袭宿主红细胞。3、GAP40蛋白敲减不影响内膜复合体的形成和结构。4、GAP40蛋白敲减影响GAP45蛋白的定位和可溶性。5、GAP40蛋白Ser370,Ser372和Ser376位点的磷酸化修饰在裂殖子入侵红细胞过程中发挥重要作用。