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研究背景与目的:关节软骨缺损是临床上常见的病症,由于关节软骨没有血管、神经、淋巴系统分布,含有的软骨细胞量少、迁移和增殖能力有限,一旦造成损伤难以自愈。如不进行及时有效的治疗,损伤将继续加重并引发骨关节炎,导致出现关节疼痛肿胀或运动障碍。当前临床上常见的治疗方法有微骨折和自体软骨细胞移植技术,但还没有一种治疗手段被证明可以成功地还原正常的透明软骨,软骨修复组织的组成大多是纤维软骨。在过去的几十年里,随着研究的深入和技术的发展,相对于其他的治疗方法,组织工程技术是前景更为广阔的软骨修复方法。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)具有获取方便、增殖及分化能力强、无排斥反应等优点,在合适的生化和物理刺激下可向软骨细胞分化,是理想的软骨修复的细胞来源。迄今为止,以BMSCs做为种子细胞的组织工程软骨的相关研究已非常丰富,但很多研究主要关注组织工程软骨的修复效果,以及支架材料和生物活性因子的选择以促进和诱导BMSCs向软骨细胞分化。而对BMSCs在软骨修复过程中的生存、转归以及发挥的作用,仍缺少足够的研究,而加强这些认识,有助于我们对基于BMSCs的组织工程软骨的客观评价和优化,有助于未来BMSCs在临床上的应用。本研究旨在应用课题组研制的Ⅱ型胶原-透明质酸-氧化硫酸软骨素(ColⅡ-HA-OCS)仿生凝胶模拟正常软骨的细胞外基质,以羟基荧光素乙酰乙酸(5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFDA SE)标记的猪自体BMSCs作为种子细胞,修复猪膝关节软骨缺损,探索移植的BMSCs在修复组织中的生存、增殖及分化情况。研究方法:1、取巴马小香猪12只,每只通过骨髓穿刺获取骨髓血,以猪BMSCs分离液分离出BMSCs,培养至P2代细胞,以CFDA SE标记BMSCs并检测标记率。2、所取的巴马小香猪每只取一侧膝进行实验,共12膝。手术切开关节囊,显露股骨滑车关节面,用直径8mm的空心环钻在软骨负重区关节面钻出缺损范围,清除缺损区域的软骨,完成关节软骨缺损模型。小香猪随机分为3组,每组4膝。A组为空白对照组,对缺损不做处理;B组为无细胞仿生凝胶组,缺损内仅植入仿生凝胶;C组为自体BMSCs复合仿生凝胶组,缺损内植入CFDA SE标记的自体BMSCs复合仿生凝胶。3、术后1个月,于取材前24h和48h按25mg/Kg对实验动物静脉注射5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,Brd U)标记液,并处死动物取标本。进行大体、体式显微镜及组织学观察,并按ICRS大体形态评分方法和ICRS组织学评分方法进行评分。自体BMSC复合仿生凝胶组取部分软骨修复组织,做冰冻切片后,进行DAPI染色及Brd U免疫荧光染色,于激光共聚焦显微镜下对标记细胞进行观察、计数,计算植入细胞占存活细胞比率和具有增殖能力的存活植入细胞比率。研究结果:1、CFDA SE标记猪BMSCs的即刻标记率为(99.34±0.43)%,其后1、3、5、7d的标记率分别为(98.72±0.31)%、(98.51±0.45)%、(98.33±0.37)%和(98.17±0.34)%。2、术后1月,空白对照组缺损区域内基本无填充物;无细胞仿生凝胶组缺损区域底部有少量纤维样组织覆盖,靠近缺损边缘修复效果较好,细胞含量少;自体BMSCs复合仿生凝胶组缺损区域被软骨样组织填充且与周围正常软骨整合良好,细胞含量较多,呈不规则分布,可见少量软骨陷窝,组织学染色接近邻近的正常软骨3、自体BMSCs复合仿生凝胶组的修复组织通过激光共聚焦显微镜观察、计数,植入细胞占存活细胞比率为(97.33±2.57)%,具有增殖能力的存活植入细胞比率为(76.57±2.51)%。4、ICRS大体形态评分:空白对照组(0.50±0.58)分,无细胞仿生凝胶组(2.25±0.50)分,自体BMSCs复合仿生凝胶组(8.25±0.96)分;ICRS组织学评分:空白对照组(0.50±0.58)分,无细胞仿生凝胶组(4.50±1.00)分,自体BMSCs复合仿生凝胶组为(10.25±2.36)分。自体BMSCs复合仿生凝胶组的评分均显著高于其他两组,差异有统计学意义(P<0.05)。研究结论:1、CFDA SE标记猪BMSCs是一种高效且稳定的细胞标记方法,在植入动物体内一个月后,仍可以清楚地观察到植入细胞。2、自体BMSCs复合仿生凝胶修复猪膝关节软骨缺损,能达到良好的修复效果,修复组织接近正常软骨,修复效果显著高于空白对照组和无细胞仿生凝胶组。3、自体BMSCs复合仿生凝胶组的修复组织中,生存的细胞基本源于植入的BMSCs,其增殖能力降低,分泌ColⅡ和糖胺聚糖,在逐渐分化为软骨细胞。