18种斑翅蝗的基因组大小与重复序列分析

来源 :陕西师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:andrew142
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[目的]斑翅蝗科(Oedipodidae)我国已知40属约156种,广泛分布于全国各地,在干温地带(如陕西、宁夏、内蒙古和新疆等)最多。我们的研究发现该科蝗虫的基因组存在增大现象,而基因组大小的变异与基因组中重复序列的类型和含量有关。本研究在测定该科18种蝗虫基因组大小的基础上,对8个物种的染色体进行了核型分析,然后结合高通量测序与生物信息学分析了该科基因组中重复序列的类型和含量,以及对不同物种间的重复序列进行比较,并且使用荧光原位杂交实验对宁夏束颈蝗(Sphingonotus ningsianus)的卫星DNA和LTR等重复序列进行验证,以揭示其在染色体上的分布特征。最后,基于线粒体基因组数据集,运用最大似然法构建了斑翅蝗科18个物种的系统发育关系,探讨了该科基因组大小和性染色体相对长度的进化模式。[方法](1)以雄性东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis)作为内部参照,使用流式细胞术测定斑翅蝗科18个物种的基因组大小。(2)采用常规染色体制片法对8个物种进行核型分析。(3)使用Illumina平台对所有物种DNA进行二代测序,分别使用本地安装的和线上Galaxy平台的RepeatExplorer2软件对测序结果进行生物信息学分析,得到各物种基因组中重复序列的含量,随后对其进行比较分析;然后又对宁夏束颈蝗(S.ningsianus)的重复序列进行深度分析,找出基因组中的重复序列种类及含量。(4)基于各物种的线粒体基因组序列,以癞蝗科的笨蝗(Haplotropis brunneriana)、斑腿蝗科的短星翅蝗(Calliptamus abbreviatus)和黑腿星翅蝗(Calliptamus barbarus)、网翅蝗科的素色异爪蝗(Euchorthippus unicolor)和宽翅曲背蝗(Pararcyptera microptera meridionalis)作为外群,使用最大似然法构建斑翅蝗科18个物种的系统树,接着在R3.5.3中对基因组大小和性染色体相对长度进行了系统发育信号分析;另外使用MEGAX对宁夏束颈蝗(S.ningsianus)的153条LTR也构建了系统树。(5)基于生物信息学分析的结果,随机选取5个重复序列,包括4个卫星DNA和1个LTR,使用SnapGene设计引物,最后利用引物和前面制备好的雄性染色体玻片,对其进行荧光原位杂交实验。[结果](1)本实验共测定斑翅蝗科18种蝗虫的基因组大小,其平均基因组大小为12.006pg。基因组大小在种间差异较大,基因组最小的是花胫绿纹蝗(Aiolopus tamulus)♀9.177 和♂7.858pg,最大的是黄胫异痂蝗(Bryodemella holdereri)♀18.041pg和♂17.601 pg,两个物种的雌雄均相差近2倍;在对各物种雌雄间的基因组大小进行比较时发现,雌性蝗虫的平均基因组大小为13.513pg,雄性蝗虫的平均基因组大小为12.560pg,二者相差0.953pg,雌性个体的基因组均大于雄性个体。(2)对斑翅蝗科8个物种的核型分析发现所有物种的染色体数目均为2n(♂)=23,其中云斑车蝗(Gastrimargus marmoratus)的性染色体为大型染色体,位于整个染色体组的第2位;宁夏束颈蝗(S.ningsianus)、花胫绿纹蝗(Ai.tamulus)和亚洲小车蝗(Oedaleus asiaticus)的性染色体为中型染色体;红胫小车蝗(Oedaleus manjius)、红翅皱膝蝗(Angaracris rhodopa)和科氏痂蝗(Bryodema kozlovi)的性染色体最小,且位于整个染色体组的最末位,为小型染色体,黄胫异痂蝗(B.holdereri)的性染色体虽不是整个染色体组中最小的,但属于小型染色体。(3)宁夏束颈蝗(S.ningsianus)的基因组中有74.62%的重复序列,并且有59.26%的序列被注释为top clusters;可以被注释的重复序列中移动元件占19.33%,包括 8.39%Ty3grpsy,7.17%LINE,2.08%Maverick,1.63%Penelope,0.02%Helitron和0.04%未分类的逆转录转座子;卫星DNA的含量为2.94%,rDNA仅有0.14%;另外,对宁夏束颈蝗(S.ningsianus)重复序列的110条top clusters进行聚类,发现序列数最多的是LINE和LTR,分别为27条和26条,其次是卫星DNA和Maverick,分别为7条和8条,Penelope、Helitron和rDNA的含量最少,这一结果与该物种重复序列的总体注释结果相吻合。(4)斑翅蝗科18个物种中,除了科氏痂蝗(B.kozlovi)(46.64%)以外,其他物种的重复序列均占整个基因组的50%以上,而红翅皱膝蝗(An.rhodopa)、宁夏束颈蝗(S.ningsianus)、红胫小车蝗(O.manjius)、大垫尖翅蝗(Epacromius coerulipes)和鼓翅皱膝蝗(Angaracris barabensis)的重复序列含量最多,分别占整个基因组的76.68%、74.62%、74.05%、71.52%和71.25%。另外还对所有物种重复序列的top clusters进行了聚类分析,发现云斑车蝗(G.marmoratus)、亚洲小车蝗(O.asiaticus)、花胫绿纹蝗(Ai.tamulus)、疣蝗(Trilophidia annulata)和大垫尖翅蝗(E.coerulipes)含有各自特定的卫星DNA;而宁夏束颈蝗(S.ningsianus)、土库曼束颈蝗(Sphingonotus turcmenus)和细距蝗(Leptopternis gracilis)有共同的卫星 DNA、Ty3gypsy 和 LINE;CL58-148 以及 CL191-136是所有物种共有的重复序列,值得注意的是,CL123对应的5SrDNA和CL131、CL148对应的45SrDNA只检测到一次,并且存在于所有物种的基因组中。(5)构建了斑翅蝗科18个物种的系统发育树;然后分别将雌雄昆虫的基因组大小、性染色体相对长度与系统树进行拟合,发现基因组大小有明显的系统发育依赖性,而染色体的相对长度没有系统发育依赖性;宁夏束颈蝗(S.ningsianus)LTR的系统发育关系显示LTR中BelPao和Tylcopia的亲缘关系较近,Tylcopia(6)和Ty3gypsy是姐妹群,Ty3gypsy可分为四个分支。(6)荧光原位杂交实验发现HS1在每条染色体臂上都有杂交信号,HS2和HS3对应的重复序列在所有染色体的着丝粒处有1个清晰明亮的杂交信号,LS1对应的重复序列只在某些染色体臂的末端观察到了明亮的信号,LTR1对应的重复序列位于染色体臂的不同部位。
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